1. küçük Lipid veziküller hazırlanması
<ol><li>Lipidler SPE/DOPS/ATTO488-DOPE kloroform içinde bir çözüm 79/20/1.The kloroform lipidler konsantrasyonu 1 mg/mL ve son kitle 0.6 mg (genellikle daha az 1 mg) son oranı karıştırma bir kitle ile hazırlayın. Kullanım alt cam şişe (yuvarlak alt cam tüpler, 10 x 75 mm) yuvarlak lipid çözüm önceden temizlik adım olmadan hazırlarken tek kullanımlık.<ol>
<li>Doldurun ve kullanımdan önce en az 5 kez kloroform ile cam şırınga (25 µL) durulayın. Doldurun ve cam şırınga en az 5 kez durulama için 3-4 mL kloroform yeterlidir. Dikkat: Ne zaman kloroform, işleme cam şırınga kullanın ve uygun eldiven giyerken duman mahallede tüm yordamları gerçekleştirmek ve koruyucu gözlük her zaman. Herhangi bir plastik şişeler, şırınga veya pipetler kloroform işlerken kullanmayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ortam ışığı içeriği korumak ve 3 h için bir döner buharlaştırıcı-7 kPa vakum 80 devirde ulaşan basınç ile kloroform kaldırmak için solvent buharlaşır için metal folyo ile lipid karışımı içeren cam şişe kaydır. Bir kuru lipid film cam şişe dibinde buharlaşma (Şekil 2A) sonra oluşur. Not: birkaç kez ölçeklendirmesinin ve lipidler daha büyük miktarda tam kloroform kaldırılmasını sağlamak için daha uzun döner buharlaşma zaman gerektirebilir.</li>
	<li>Fosfat 600 µL serum fizyolojik (PBS) arabellek çözüm (pH 7.8, seyreltme olmadan) kurutulmuş lipit filmin üstüne arabelleğe yavaş yavaş ekleyin. Arabellek ek, yavaşça gliserol Şef-MLV oluşumu (gliserol 1 wt % son bir konsantrasyon ulaşmak) adımları36sırasında tam dehidratasyon örnek korumak için 6 µL ekleyin. Parafilm ve kapak metal folyo ile ortam ışığı korumak için kullandığı cam şişe kapatın. Gecede 4 ° C'de buzdolabında saklayın. Not: PBS arabellek çözüm Trizma tabanının 0.151 g, K3PO41.592 g, KH2PO41.021 g, MgSO4 ·7H2O 0,062 g ve EDTA 0.0465 g 250 mL saf su içinde oluşur. Çözüm 4 ° C'de depolayın ve oda sıcaklığında önce kullanım için sıcak. 10 mM HEPES tampon eşdeğer miktarda PBS çözüm yerine kullanılabilir. HEPES tampon çözüm 1 M HEPES hisse senedi çözüm arıtılmış su ile sulandrarak hazırlanır.</li>
	<li>Ertesi gün, bir ultrasonication Banyosu oda sıcaklığında kullanarak 1dk için solüsyon içeren cam şişe solüsyon içeren temizleyicide. Parafilm kaldırın ve küçük lipid veziküller görsel olarak tek tip bir çözüm oluşturulur kadar pipet (Şekil 2B). Aliquot 30 µL elde edilen küçük lipid vezikül çözüm bireysel 0.5 mL Plastik tüpler içine. Bu hisse senedi aliquots en fazla 6 ay için-18 ° C'de tutun. Not: küçük lipid vezikül çözüm yoksa görsel olarak üniforma, girdap 4 kez 1-2 s maksimum hızda bir girdap Mikser kullanarak için çözüm.</li>
</ol>2. Şef-MLV konut projeleri hazırlanması
<ol><li>Oda sıcaklığında bir aliquot küçük lipid veziküller donmuş süspansiyon içeren bir plastik tüp çözülme. Burgaç 4 kez 1-2 s maksimum hızda bir girdap Mikser kullanarak için tüp.</li>
	<li>Yer 5 µL küçük lipid vezikül süspansiyon bir cam kapak küçük oluşturmak için Not (24 x 60 mm) yüzeyinin damlacık yuvarlak. Cam kapak kayma olmadan herhangi bir ön temizleme adımları kullanın.</li>
	<li>Cam kapak notu bir vakum desiccator yer (< 100 kPa vakum) 20 dk için.</li>
	<li>Kurutulmuş lipit filmin 4 dakika oda sıcaklığında saklamak, sonra yavaş yavaş 10 mM HEPES tampon rehidrasyon için kuru lipid film üstüne 50 µL pipet. Şef-MLV kompleksleri (Şekil 2C) önceden oluşturmak için 5 dakika bekleyin.</li>
	<li>Bir cam kapak notu mikroskop sahnede merkezi sonra 300 µL üzerine HEPES tampon pipet ve damlacık amacı (3B rakam) yukarıda ortasına konumlandırın.</li>
	<li>Önceden biçimlendirilmiş Şef-MLV çözüm 50 µL HEPES çözüm (300 µL) aktarın. 25 dk seyrek kurulan Şef-MLV kompleksleri sıkıca cam kapak notu (2D rakam) yüzeye bağlı kalmak izin istiyorum. Not: Bazen, cam kapak fişinde Şef-MLV kompleksleri oluşturmaz ve lipid yamalar veya sadece MLVs gözlenir. Bu yanlışlıkla örneği adımları sırasında küçük vezikül süspansiyon 2.4 veya 2.6 veya çok sayıda donma-çözülme çevrimleri sallayarak tarafından açıklanabilir. 2.1-2,6 olan adımları yineleyin veya taze hazırlanmış lipid hisse senedi çözüm (adım 1.1) Şef-MLV kompleksler elde etmek için kullanın.</li>
</ol>3. micropipette hazırlanması ve mikroenjeksiyon
<ol><li>Micropipette sahibine eklenirken kırık micropipette önlemek için bir mum alevi içine yavaşça kılcal yerleştirerek borosilikat cam kılcal kenarları yuvarlak biter.</li>
	<li>Program seti kullanarak bir otomatik lazer çektirme kullanarak en az 3 cam kılcal çekin: ısı 400, FIL = = 4, Vel 50, Del = 225, Pul = =; Isı 400, FIL = 4, Vel = 60, Del = 150, Pul = 120 =. Program kümesi boş bırakılan Pul ilk değeri ile girilmesi gerekir. Borosilikat cam kılcal iç çapı (kimlik) kullanarak 1.00 mm ve dış çap (OD) 0,78 mm bir micropipette çapı yaklaşık 0.3 µm bir ipucu açılış ile sonuçlanır.</li>
	<li>Arka-dolgu ile 8 µL 5 mm CaCl2 çözüm HEPES tampon (10 mM) bir microloader kullanarak her micropipette. 0,2-0,5 kullanarak CaCl2 çözüm filtre µm şırınga filtre kullanımı pipet ucu tıkanmasını önlemek için önce. Not: CaCl2 tamamen adımları 2,4-2,6 için de kullanılır HEPES tampon çözelti içinde çözünmüş olun.</li>
	<li>Bir micropipette sahibi bir micromanipulator bağlayın. Micropipette micropipette yuvasına sıkıca bağlayın. Enjeksiyon pompası ve kapiller tutucu kaynağı tüp kullanarak bağlayın.</li>
	<li>Enjeksiyon pompası başlatın. Enjeksiyon pompası 20 hPa (enjeksiyon basıncı) için ayarları ve bir 5 inç tazminat basınç otomatik modunu ayarlayın. Micropipette mikroenjeksiyon için hazır olması ne kadar enjeksiyon pompası duraklatın.</li>
	<li>Mikroskop aydınlık alan moda ayarlayın. Fark girişim kontrast (DIC) yapılandırın. 63 X veya 100 X Yüksek NA (1.3) amaçları en iyi membran kenar çözünürlük elde etmek için kullanın.</li>
	<li>Kaba micromanipulator micropipette Şef-MLV kompleksleri içeren damlacık yukarıda konumlandırmak için kullanın. Yukarıda amaç micropipette ucu bulun.</li>
	<li>Mikroskop Şef-MLV kompleks orta noktasını odaklanmak ve yaklaşık 50 µm Şef yukarıda tekrar odaklayın. Yavaşça micropipette odak haline getirmek için micromanipulator kaba modunu kullanın.</li>
	<li>Micromanipulator iyi moduna geçirin. Yavaş yavaş micropipette ucunu aşağı çevirmek ve ucu odak tutmak ise şef yüzeye yönlendirmesi. Micropipette ipucu yaklaşık 20 µm Şef yüzeyinden getirin. Micropipette ucu cam kapak notu ( Şekil 5Börnekte) ile yanlışlıkla temas nedeniyle kırık değilse, hemen gereksiz kalsiyum iyon yayın örnek toplu çözüm içine önlemek için değiştirin.</li>
</ol>4. oluşumu ve kalsiyum İyon kaynağı kullanarak MTPs çeviri
<ol><li>Mikroskop floresans moduna ayarlayın. Ayarla dichroics 488 heyecanlandırmak için nm ve 505-550 nm, emisyon tespit.</li>
	<li>Enjeksiyon pompası üzerinde geçiş ve kalsiyum iyon enjeksiyon başlar. Micromanipulator iyi modunu kullanacak ve yavaş yavaş micropipette ucu Şef e yaklaşım. Micropipette ipucu MTPs formu (Şekil 4) izin vermek için micropipette CaCl2 çözümden enjekte ederken 3 µm membran yüzey uzaklıkta yerleştirin.</li>
	<li>MTPs Şef yüzeyi boyunca çevirmek için yavaş yavaş hareket pipet ucu (0,1-0,3 hızı µm/s) Şef yüzey iyi micromanipulator (Şekil 6) kullanarak. Yaklaşık olarak aynı uzaklıkta (3 µm) Şef yüzey ve belgili tanımlık micropipette uç arasında kalsiyum iyon enjeksiyon devam ederken korumak. Not: micropipette İpucu (yukarıda 0.7 µm/s) yüksek çeviri oranlarda MTPs BT'nin micropipette de geçirmeyecektir. Bunun yerine, dağılım ve kısaltmak, yeni MTPs micropipette ucu (Şekil 7) yeni konumda oluşturulacak iken.</li>
	<li>Mikroenjeksiyon durdurmak için enjeksiyon pompa kapatmak ve Şef yüzey uzak micropipette hareket.</li>
</ol>

BioMimetic hücre sistemleri membran davranış iyonları, proteinler veya nano tanecikleri gibi dış uyaranlara karşı maruz üzerine bir çalışma için izin verir. Böyle bir model olmak gUVs, kimyasal ortamda değişiklikler sık sık tübüler yapılar ve invaginations24,41,42,43 oluşumu içerir onların şekli ayarlayarak yanıt verebilir .
Bu makale, MTPs Şef yüzey üzerine yerelleştirilmiş enjeksiyon Şef yüzeyinde kalsiyum iyonlarının remodeling ile temassız bir şekilde oluşturmak için bir yaklaşım sunar. Protokol ne kadar kalsiyum oluşturmak için bir mikroenjeksiyon tekniği kullanırım için iyon degradeler Şef e yakın forma MTPs yüzey de bir hücre plazma zarı taklit eden Şef-MLV kompleks hazırlanması açıklar. Kalsiyum iyon-membran etkileşimleri ele önceki deneysel çalışmalarda çoğunluğu kalsiyum iyon konsantrasyonu14,17toplu olarak lipid veziküller maruz. Deneysel koşullarına bağlı olarak, bu tür toplu poz yok borulu çıkıntılar oluşan25farklı membran yanıtta neden olabilir.
Şef-MLV kompleksleri oluşumu oldukça basittir ve sadece standart Laboratuar donanımları, rotary evaporatör, ultrasonik banyo ve vakum desiccator gibi gerektirir. Yine de, vezikül hazırlık sırasında göz önünde bulundurulacak çeşitli kritik adımlar vardır. (Veziküller susuzluktan adım iletişim kuralı sırasında 2.3) tamamlandıktan ve az miktarda tuz kristallerinin içeren bir Kuru dairesel lipid film cam kapak kayma yüzeyi üzerinde oluşturulur emin olmak önemlidir. Deneme sırasında dikkatli vezikül çözümü, işleme kloroform yanı sıra taze HEPES tampon, taze lipid hisse senedi çözüm kullanmaktır Şef-MLV kompleksleri başarılı hazırlanması için gerekli. Ayrıca, güvenli bağlanma cam kapak kayma yüzeyi Şef-MLV kompleks embriyolardan ve mikroenjeksiyon için çok önemlidir. Şef MLV yeterli yapışma onaylamak için karmaşık, micropipette (enjeksiyon akışı) olmadan yavaşça Şef yüzeyine karşı itmek için kullanılabilir. Sıkıca yapıştırılan bir vezikül üzerine doğrudan fiziksel temas yüzeyi boyunca kaydırın değil. Çünkü deneyler için birkaç saat sorguya, bir açık arabellek damlacık içinde gerçekleştirilir buharlaşma dikkate alınması gerekir. Buharlaşma arabellek damlacık gelen etkiler ve veziküller istikrarsızlaştırmak ozmotik koşullar değişecek. Ozmotik koşullar geri yüklemek için sistem periyodik özgün birimi geri yüklemek için örnek için saf su ilavesi homeostazı için döndürür.
Lipid membran kompozisyon değiştirirken MLV membran yeniden şekillendirme sırasında Şef'e lipid malzeme aktarmak için izin verdiğinden veziküller Şef-MLV kompleksi şeklinde üretilen önemlidir. Önceki çalışmalar ile saf lipidler SPE karışımı bileşenleri değiştirme veya kolesterol, % 5-30'u eklemek de Şef-MLV karmaşık oluşumu28,44için sağlar göstermiştir. Hazırlanan GUVs unilamellar45çoğu.
Ayrıca, magnezyum iyonları gibi diğer divalent katyonlar sınarken MTPs oluşumu ağır lipid karışımı olumsuz ücret DOPS varlığını bağlıdır. DOPS, bu protokol için açıklanan veziküller içinde MTPs oluşturmaz. Ayrıca, potasyum ve sodyum, gibi monovalent katyon oluşumunda MTPs, hatta veziküller25DOPS içeren, neden değil.
Hazırlık ve GUVs manipülasyon ile ilgili kritik adımlarına ek olarak, mikroenjeksiyon işlemi sırasında göz önünde bulundurulacak çeşitli faktörler önemli. Kalsiyum iyonlarının başarılı mikroenjeksiyon ağır düzgün çalışıp dayanmaktadır cam deneme günü hazır mısın Mikropipetler. Çeşitli faktörler micropipette çalışmasına neden olabilir. Ortak bir akıl tıkanmış ipucu açıyor. Yan vezikül hazırlanması, çözüm içinde dağınık ve böylece bir tıkanma üreten micropipette ucuna kadar uygun eğilimi küçük lipid parçacıkları. Pipet Ucu temizleme en iyi vezikül eriyik--dan yukarı kaldırarak ve Şef yüzeye yakın yerleştirerek yapılır. Çünkü toplu çözüm içine kalsiyum iyonlarının büyük enjeksiyon içinde sonuçlar mikroenjeksiyon pompa blow-out işlevinin kullanımını kaçınılmalıdır. Ayrıca, küçük hava kabarcıkları micropipette içinde entrapped uygun mikroenjeksiyon, dava micropipette yenisi ile değiştirilmelidir önlemek. İpucu kırılması önemli ölçüde deneysel Kur ipucu salınımlarını en aza indirmek için bir titreşim nemlendirme masaya yerleştirerek en aza indirilebilir.
Ayrıca, bakım photobleaching zaman karar vermek en iyi görüntüleri elde ederken en aza indirmek için bir gözlem düzeni seçerken alınması gerekiyor. Çünkü bir objektif sınırlı sonda derinlikte bir nispeten yüksek görüntü edinme oranı sağlar geniş alanlı lazer kaynaklı floresans mikroskobu bu protokol için kullanılmıştır. Ayrıca, ters mikroskobu kullanımını eşzamanlı mikroenjeksiyon ve lipid veziküller ve MTPs gözlem olanağı sağlar.
Bir sunulan yönteminin ana sınırlamaları kapsamlı el ile çalışmaları ve yeterli embriyolardan becerileri gereksinimdir. Kompleksleri bir spontan şişme sürecinde oluşur çünkü, GUVs ve MLVs boyutunu kontrol edilemez. Ayrıca, bu iletişim kuralını membran yenileme ile ilgili ek ayrıntıları toplamak gerekli olabilir hazır şef-MLV kompleksleri membran gerginlik kontrolü için izin vermez. GUVs MLVs sadece GUVs kullanılabilir membran kullanarak elde etmek imkansız bir ölçüde MTPs önemli büyüme için ikinci sağlama lipid malzeme ile bağlanır. MLVs de hangi vezikül gerilimi micropipette aspirasyon kullanarak denetlemek için girişimleri karmaşık Şef-MLV karmaşık44içinde herhangi bir yan yüzey gerilimi varyasyonları düşürülmesi için katkıda bulunur. Bu Şef-MLV tabanlı model daha iyi membran kıvrımlar ve invaginations46gibi membran su depoları bağlı hücresel membran yapılar bulunan gerginlik rejimler taklit eden bir alt gerginlik sağlar. Aynı zamanda, micropipette Aspirasyon tekniği başarıyla tek GUVs membran gerginlik denetlemek için uygulanabilir. Örneğin, Graber vd. eseri ayrıntıları membran borulu invaginations bağlama üzerine tek GUVs içinde kalsiyum iyonlarının oluşumu için toplu koşulları, membran çeşitli gerilim rejimler40sağlanan. Son olarak, hem yerel hem de toplu pozda kalsiyum için membran davranışının karşılaştırma bu protokolü kapsamý dýþýndadýr yüzeye membran yapıştırılması Gelişmiş denetimi gerektirir.
Özetlemek gerekirse, temassız membran yenileme ve kalsiyum iyonları ile yerelleştirilmiş stimülasyon üzerine MTPs oluşumu için önerilen tekniği sağlar. Sentetik vezikül sistemlerden çeviri için hücre blebs gibi yerel biyolojik membranlar üzerinde bu yöntemi merkezinin gelecekteki uygulamalar. Önerilen yöntem Birleşmiş amperometry, yama-kelepçe veya elektrot gibi diğer tek hücreli sorgulama düzenleri ile veya ile birlikte lokalize stratejileri31,47,48Isıtma. Diğer iyonlar veya moleküller etkisini test basittir ve sadece faiz molekülleri ile kalsiyum iyonları yerine içerir. Ayrıca, karmaşık sentetik lipid veziküller ile yerel algılama ile ilişkili hücre yeniden şekillendirilmesi ve hücre zarının dinamiği Biyofizik anlayışımızı genişleyebilir transmembran proteinler membran functionalization yoluyla üretilen kimyasal degradeler. Son olarak, lipid membran temassız uyarılması da polimer yumuşak madde sistemleri, bir roman temassız manipülasyon platform için bir temel sunan için tercüme edilebilir.

Kalsiyum iyonları Biyolojik süreçler, sinyal, hücre bölünmesi ve membran fusion, özellikle onların katılımı içinde odak birçok mekanik çalışmalar1rolüdür. Hücre içi sitoplazmik kalsiyum iyonu konsantrasyonu sırasına 100dür nM, endoplazmik retikulum, salgı veziküller ve mitokondri, gibi organellerin kalsiyum süre kadar millimolars konsantrasyon onlarca düzeyleri ulaşmak. Bu hücre içi membranlar2,3,4,5,6,7arasında,8 dik kalsiyum iyon konsantrasyonu degrade büyüklük oluşturur ,9. Ekstrasellüler kalsiyum iyon düzeyi 2 mM civarında ve bu nedenle, her iki hücre dışı ve hücre içi düzeyde kalsiyum iyonu konsantrasyonu varyasyonları oluşur. Ayrıca, son çalışmalar bu hücre içi kalsiyum iyon olaylar sinyalizasyon kanıt ve nöronal aktivite ekstraselüler kalsiyum iyon konsantrasyonlarının, önemini gösteren yerel dalgalanmalar koşullar altında ortaya çıkabilir senkronize Intra - ve ekstraselüler kalsiyum iyon değişimleri10.
Kalsiyum iyonları ve biyolojik membranlar, yerel hücre zarlarında lipid bilayer veziküller ile yerine sentetik bir yaklaşım arasındaki etkileşimi anlamak amaçlayan başarıyla uygulamaya konmuştur. Veziküller kalsiyum iyon çözümlere açığa lipid kafa grupları ve hidrokarbon zinciri ambalaj, artan membran gerginlik ve vezikül toplama yanı sıra lipidler ve membran faz geçiş11,12 ayrılığı değişikliklere yol açar ,13,14,15,16. Lipid membranlar maruz kalsiyum iyonları için üzerine özelliklerini x-ışını, 1H-NMR ve spektroskopik veya termodinamik çalışmalar11,16, bu tür Deneysel teknikler kullanarak araştırdık 17 , 18. bu çalışmalarda membran kompozisyon kez yerel hücre zarlarında benzemek için ayarlanmıştır ve fizyolojik böyle lipidler phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE) ve Fosfatidilserin (PS) içerir. PS hücre içi membran kaçakçılığı, ekzositozu ve Apoptozis19,20de dahil olmak üzere birçok hücresel süreçlerinde önemli bir bileşeni olduğundan yapay vezikül hazırlanmasında özellikle önemlidir.
Sentezlenmiş lipid veziküller boyutunu kez nanometre birkaç mikrometre arasında değişmektedir. Farklı vezikül hazırlıkları arasında dev unilamellar veziküller (GUVs), hangi are birkaç mikrometre çapında onlarca için bireysel boyutları hücreleri21 yakından benzeyen onların nispeten büyük boyutları nedeniyle özellikle önem vardır , 22 , 23. GUVs mevcut yüzey alanı yerel kimyasal degradeler etkisi incelenecektir için membran biyofiziksel özellikleri sağlar. Membran yüzey dış uyaranlara karşı yalnızca bir bölümünü açarak, membran dynamics daha yakından soruşturma. Örneğin, kimyasal ya da pH degradeler yerelleştirilmiş uygulama GUVs yüzeyine toplu poz24,25, gözlenen değil borulu çıkıntılar oluşumuna yol açar gösterilmiştir. Hücre zarının remodeling mekanizmaları biraz anlayışlar kazanmak için tek veziküllü sorgulama düzenleri yöntem geliştirilmesi için gözlenen membran davranış farklılıkları arayın.
Embriyolardan erken 1900'lerde26,ile27, 2000'lerde23,28 tek veziküllü manipülasyon düzenlerinden daha yeni gelişmeler ile bağlantılı olarak ve mikroenjeksiyon yöntemleri üzerine bina , bu makalede hangi membran yenileme ve membran borulu çıkıntılar (MTPs) Şef membran oluşumu oluşturulur kalsiyum iyonlarının yerel uygulama yanıt olarak bir yaklaşım sunuyor.
Yaklaşımımız bir biomimetic membran modeli sistemi (Şekil 1A) multilamellar bir vezikül (MLV) bağlı bir şef oluşan karmaşık bir vezikül kullanır. MLV olarak lipid depo kompleks kalsiyum iyon degrade maruz sırasında Şef lipid malzeme sağlamak için gereklidir. Bu bağlantı indüklenen tadilat sırasında membran gerginlik artışı telafi etmek ve Şef membran geçiş şekil ve lipidler MTP büyüme için sağlamak için karmaşık tanır. Kütlesi büyük olduğu için Ayrıca, yüzey immobilizasyon MLV kolaylaştırır Şef e kıyasla. Ne zaman bir katı substrat immobilize Şef-MLV kompleksleri daha önce nanotüp veziküllü ağlar üreten, polimer membran etkileşim eğitim ve ekzositozu29,30geç aşamalarında taklit için kullanılmıştır, 31,32,33.
Önceki iletişim kuralları soya polar lipit özü (SPE) Şef-MLV kompleksleri28hazırlamak için kullanılan. SPE phosphatidic asit (PA, % 6,9) ve diğer lipidler (% 6,9) karışımı içeren PC (%45.7), PE (%22,1), phosphatidylinositol (PI, %18,4), fosfolipitler karışımından oluşur. Burada bizim protokolünde, 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodyum tuzu) % 20'si ile SPE karışımı katkılı hücre plazma zarı iç broşürü taklit etmek için (DOPS). Ek bir %1 sınav 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-DOPE) membran floresans mikroskobu kullanılarak remodeling izleme özelliğini etkinleştirme lipid bilayer leke için kullanılır. GUVs simetrik lipid kompozisyon var bilayer arasında ve yerel olarak kalsiyum klorür (CaCl2) 5 mM konsantrasyonları maruz kalır. Bu deneysel koşullar, bir yüksek kalsiyum iyonu konsantrasyonu ile Ayrıca PS molekülleri ifade34nerede apoptotik hücrelerin dış membran broşür taklit. Şef-MLV kompleksleri oluşumu başlangıçta Criado ve Keller35tarafından geliştirilen bir değiştirilmiş rehidratasyon su kaybı yöntemi kullanılmasını gerektirir. Vezikül hazırlık Protokolü sonra küçük veziküller içinde çözüm oluşturmak için kullanılan bir kuru lipid tabakanın oluşumu içerir. Bu çözüm sonra susuz ve son Şef-MLV konut projeleri oluşturmak üzere rehydrated. Şekil 2A -D tipik bir şef-MLV kompleks hazırlanması için ana adımları göstermektedir.
Vezikül hazırlık tamamlanmış ve karmaşık vezikül cam alt katman üzerinde immobilize sonra mikroenjeksiyon tekniği ile bir açık uçlu cam micropipette Şef e dış broşürü az miktarda kalsiyum iyonları sunmak için kullanılır. Kalsiyum çözüm ucu dışarı akışını membran yenileme ve MTPs nesil için önde gelen Şef membran yüzeyinde lokalize kalsiyum iyon degrade oluşturur. MTPs kalsiyum İyon kaynağı uzak odaklı ve Şef içinde büyür. Bu MTP oluşumu doğrudan floresans mikroskobu aracılığıyla izlenebilir ve bir dijital kamera ile kaydedildi. Şekil 3 membran remodeling üretmek için kullanılan deneysel kurulumu gösterir. Bu iletişim kuralı (Şekil 2E ve Şekil 4) MTPs oluşumu toplu güç koşullarda gerçekleştirilen kalsiyum iyon pozlama deneyler için zıt bir sonuç gösterir. Toplu koşullarda GUVs rüptürü ve form için cam yüzey25uymaları gözlenen membran yamalar.
Daha Şef-MLV kompleksleri yanı sıra kalsiyum iyonları mikroenjeksiyon gerçekleştirmek için yordam oluşumu ile ilgili ayrıntılar, bu makalesinde açıklanmıştır. İletişim kuralları büyük ölçüde kalsiyum iyon mikroenjeksiyon üzerinde duruldu; Ancak, bu yaklaşım yerel veya maruz kalma diğer iyonlar proteinler nedeniyle membran yanıt eğitim kullanmak için kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, veziküller bileşimi membran yenileme sürecinde lipid bileşeni rolleri yalıtmak için ayarlanabilir. Sunulan Protokolü Şef-MLV kompleksleri üretmek için herhangi bir gelişmiş donanım gerektirmez ve tekrarlanabilirlik yüksek derecesi ile karakterizedir.

<table><tbody><tr><td>Soy bean polar lipid extract</td><td>Avanti&lt;br/&gt; Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)</td><td>541602C</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS</td><td>Avanti&lt;br/&gt; Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)</td><td>840035C</td><td>1x25 mg</td></tr><tr><td>ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)</td><td>ATTO-TEC (Germany)</td><td>AD 488-31</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Hamilton&amp;nbsp;syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25&amp;nbsp;&amp;mu;L, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51&amp;nbsp;mm (2&amp;nbsp;in.)</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>20735&amp;nbsp;SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/pack</td><td>Corning Incorporated (Corning, NY 14831)</td><td>99445-10</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform&amp;nbsp;CHROMASOLV&amp;nbsp;Plus, for HPLC, &amp;ge;99.9%, contains amylenes as stabilizer</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>650498-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>B&amp;uuml;chi Rotavapor R-144 Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm</td><td>KEBO lab (Sweden)</td><td>MA00360500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO</td><td>Sharlau Chemie S.A. (Spain)</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0%</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5%</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol, for molecular biology, minimum 99%</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>T-1503 2050 g</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>P5629-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate tribasic (K3PO4)</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>5886</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck (USA)</td><td>34549-100 g</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>H0887 Sigma&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES solution 1&amp;nbsp;M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>Z260282-1PAK</td><td>24x60 mm</td></tr><tr><td>Acrodisc&amp;nbsp;syringe filters,&amp;nbsp;PVDF membrane, diam. 13&amp;nbsp;mm, pore size 0.2&amp;nbsp;&amp;mu;m</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>631-1339&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Menzel Gl&amp;auml;zer #1, glass cover slip</td><td>VWR (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diaphragm vacuum pump for the desiccator</td><td>Vacuubrand (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonicate bath</td><td>Bandelin Sonolex (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VX-100 Lab vortexer vortex mixer</td><td>Labnet International (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm laser line&amp;nbsp;</td><td>Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microsystems&amp;nbsp;immersion oil for microscopes</td><td>Leica (Germany)</td><td>12847995&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscopy system&amp;nbsp;</td><td>Leica DM IRB (Wetzlar, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision)</td><td>Technologies GmbH (Thuringia, Germany)</td><td>300038</td><td></td></tr><tr><td>PatchStar Micromanipulator</td><td>Scientifica (Uckfield, UK)</td><td>612-7933</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10,&amp;nbsp; 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D.&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus U.K</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microloader (pipette tips)</td><td>VWR (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-2000 CO2 laser-puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments (Novato, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet</td><td>Eppendorf (Germany)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

membrane remodeling of giant vesicles in response to localized calcium ion gradients

Temel hücre süreçler, membran kaçakçılığı ve apoptosis, gibi çok çeşitli hücre zarının şekli geçişler kalsiyum iyonu konsantrasyonu yerel varyasyonlar ile aynı anda ortaya. Ana moleküler bileşenleri Bu süreçlerle ilgili tespit edilmiştir; Ancak, belirli Interplay kalsiyum iyon gradyanlar ve hücre zarı içinde lipidler arasında çok daha az, özellikle biyolojik hücreleri karmaşık yapısı nedeniyle bilinmektedir ve gözlem düzenleri, zor. Sentetik bir yaklaşım bu boşluğu için başarıyla hücre zarı taklit eder lokalize kalsiyum iyonlarının etkisi ortaya çıkarmak için uygulanır. Hücre içindeki koşullar benzemeye bir taklit kurma severalfold bir sorundur. İlk olarak, uygun boyutları ve membran kompozisyon bir yeterli biomimetic modeliyle hücrelerin fiziksel özelliklerini yakalamak için gereklidir. İkinci olarak, embriyolardan Kur az miktarda kalsiyum iyonları belirli membran konuma teslim için gereklidir. Son olarak, bir gözlem düzeni algılamak ve lipid membran yanıt dış uyarılması için kayıt için gereklidir. Bu makale, nerede multilamellar bir vezikül (MLV), bağlı bir dev unilamellar vezikül (şef) oluşan bir lipid vezikül sistemi için yerelleştirilmiş bir kalsiyum maruz kalsiyum iyon-membran etkileşim çalışmak için detaylı biomimetic yaklaşım sunar degrade mikroenjeksiyon sistemi kullanılarak oluşturulmuş. Membran iyonik etkisi dinamikleri floresans mikroskobu kullanılarak gözlenen ve video kare hızlarında kaydedildi. Membran uyarılması sonucu olarak son derece uzak membran odaklı Şef içinde oluşturduğu membran borulu çıkıntılar (MTPs) kavisli. Açıklanan yaklaşım tamamen temassız ve kontrollü bir şekilde lipid membran ve MTP üretim remodeling neden olmaktadır. Bu yaklaşım hücre zarının yeniden şekillendirilmesi mekanizmaları incelemek için yeni yollar sağlayan kalsiyum iyon-membran etkileşimlerin Ayrıntılar adres için bir araç sunar.

Bu çalışmada, Şef-MLV kompleksleri ve onlar kalsiyum iyon degradeler etkisi hücre zarı dynamics aydınlatmak için nasıl kullanılacağını göstermektedir. Şef-MLV kompleksleri yüzey bağlı bir iyon degrade mikroenjeksiyon ile kurulurken bir sabit Cep Boy taklit için izin vermek bu deneyler için gereklidir. Şef membran lokalize kalsiyum konsantrasyonu kalsiyum İyon kaynağı uzak yönetmen MTPs oluşumu ile yanıt verir. Ayrıca, MTPs Şef temassız bir şekilde micropipette ucunu membran yüzey etrafında hareket ettirerek tercüme edilebilir.
Şef-MLV hazırlık yordamı şematik gösterimi Şekil 2' de gösterilmiştir. Her ne kadar sunulan protokolünde, Şef-MLV kompleksleri zaten adımı sırasında 2.4 (Şekil 2C) önceden oluşmuş, vezikül çözüm başka bir 300 µL damlacık arabelleği (adım 2.6 Protokolü'nün) için aktarma seyrek kurulan Şef-MLV kompleksleri sağlar yeterince uygun cam alt katman. Bu şekilde, embriyolardan ve mikroenjeksiyon için uygun bir kompleks kurulur (Şekil 2B). Zaman zaman, GUVs MTP oluşum Şekil 4Agörüldüğü gibi etkilemez bir veya daha fazla sıkışmışlık lipid veziküller içerir. Bu GUVs MTPs üretmek; Ancak, sıkışmışlık veziküller büyükse görüntüleme engel. Hazır GUVs çoğunluğu (% 75 kadar) yarımküresel görünür ve MLVs için Şekil 1A' gösterildiği gibi eklenir. Bu veziküller bu protokol ana odak ve mikroenjeksiyon işlemi için uygun. Kalan GUVs yaklaşık % 25 dalgalı görünür (Şekil 1B), daha düşük bir membran gerginlik rejim gösterge olduğu. Bu dalgalı veziküller Ayrıca borulu çıkıntılar oluşumu için izin; Ancak, onlar farklı kinetik ve bu iletişim kuralı25kapsamý dýþýndadýr kurulan MTPs farklı bir morfoloji sergi. Hazırlanan veziküller tipik çapı 2-40 µm GUVs için ve MLVs için 2-15 µm arasında değişir. En iyi şef veya daha büyük boyut için kalsiyum iyonları maruz 5 mikron.
Mikropipetler singe hücreli sorgulama şemaları de olduğu gibi sentetik GUVs manipülasyon için birkaç yıl37,38gerektiren prosedürler içinde kullanılmaktadır. Bu uygulamaların çoğu micropipette ve yüzey hücreleri veya veziküller ile arasında doğrudan fiziksel temas söz konusu. Yama-klemp tekniği veya membran bağları nanotüp veziküllü ağlar23,28,39bina yanı sıra Şef zar çekerek örnekler. Son zamanlarda, Mikropipetler iyonları ve moleküllerin türdeş olmayan hücre microenvironments24,25birleştirmeye GUVs etrafında lokalize degradeler oluşturmak için de kullanılmıştır. Sunulan protokolünde düzgün işleyen micropipette (Şekil 5A) içinde bulunan çözüm serbest bırakarak Şef yüzeyinde kalsiyum iyon degrade oluşturmak için çok önemli bir faktördür. Uygun micropipette Şef yüzeyde konumlandırma ve lipid membran ile temas kaçınarak başarılı mikroenjeksiyon için gereklidir. Micropipette ipucu MTPs yakınındaki hücre zarı kalsiyum varyasyonları taklit ederken oluşturmak için en iyi bir mesafe Şef yüzeyden yaklaşık 3 µm olarak düzenlenmektedir. Micropipette ucunu kazara kırık (Şekil 5B) ise, yerine gereklidir. Hücre dışı kalsiyum konsantrasyonu için karşılık gelen 2 ve 5 mM25, MTP oluşum için sağlar, micropipette içinde daha önce test edilmiş konsantrasyon aralığı CaCl2 arasındadır. Düşük CaCl2 konsantrasyonlarda, yani, 1 mM, hiçbir MTPs gözlenir.
MTPs oluşumu üzerine kalsiyum mikroenjeksiyon MTPs pozlama (Şekil 4B) sitesinde büyüdüğünde küçük membran invaginations oluşumu ile başlar. MTPs kalsiyum iyonları maruz Şef membran kalır sürece büyümeye devam ediyor. Dalgalanma ve kalsiyum İyon kaynağı uzak (Şekil 4 c, takıma giren film 1) gelin. Ne zaman kalsiyum İyon kaynağı edildin, MTPs dağılım MTPs kalır veya yok sonuçlandırmak üzere Şef yüzey üzerinde.
MTPs oluşumu doğrudan ilişkili olduğu Şef membran maruz dış broşür için bağlama ve spontan eğriliği (m), uyarının harekete geçirilmesine karşılık lokalize kalsiyum iyon açıklanabilir kendiliğinden oluşumu gerilim σ = 2κm2 (κ ise bükme sertlik) membran bükme ve şekillendirme içe MTPs ikna etmek. Önceki raporlar membran deformasyon yoğunlaşma tarafından açıklanmış ve/veya negatif spontan eğriliği40ile sonuçlanan bağlama kalsiyum iyonlarının membran için üzerine olumsuz ücret lipidler, kümeleme olabilir göstermiştir. Alternatif olarak, Ca2 + olumsuz ücret bilayer yüzeyine güçlü bağlama maruz lipid bilayer broşür yüzey şarj yoğunluğu etkisiz hale getirir. Bu ücret yoğunluk farkı sıfır olmayan spontan eğrilik, membran25eğmek için yeterli kaynaklanan bilayer genelinde yol açar.
MTPs gözlenen oluşumu lipid membranlar kalsiyum iyonları için hassasiyet gösterir ve membran yapılar üreten bir roman temassız yaklaşım sunuyor. Kaynağını elucidating bu membran tubulation, membran şekil çeşitli hücre fonksiyonları ve hücre yeniden şekillendirme sırasında geçiş dinamiklerini anlamak için önemli olabilir ve lipid organizasyon içinde hücre içine anlayışlar kazanmak için yardımcı olabilir membranlar.
Gözlenen MTPs kalsiyum iyon pozlama geçiren membran sitede her zaman oluşturulur. Böylece, micropipette ucunu konumunu seçerek, bu çıkıntı büyüme için Şef yüzey alanını tanımlamak mümkündür. Micropipette yavaş yavaş ise ileri (0,1-0,3 µm/s) membran ayırma mesafeden koruyarak Şef yüzeyi taşındı MTPs micropipette ile tandem çevrilir. Şekil 6 ve karşılık gelen ek Movie 2 Şef yüzeyi çevresine MTPs böyle geçiş göstermektedir. Bu işlem sürekli kalsiyum iyon enjeksiyon25üzerine yeni MTPs oluşumu tarafından eşlik etmesi muhtemeldir. (Yukarıdaki 0.7 µm/s) yüksek çeviri fiyatlara MTPs micropipette ipucu takip etmek mümkün değildir. Bunun yerine, yeni çıkıntılar micropipette ucu (Şekil 7) yeni konumda oluşturulur.
Gözlenen temassız kalsiyum iyon güdümlü çevrilmesi MTPs etrafında daha fazla sürüş anlayışımız hücrelere membran yapılar dinamikleri arkasında zorlar Şef yüzey olabilir. Ayrıca, bu yaklaşım malzeme taşıma yumuşak madde sistemlerinde kimyasal degradeler kullanarak kontrol etmek için bir roman temassız modu sunuyor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig1.jpg"> Resim 1 : Bir cam kapak kayma yüzeyi üzerinde immobilize Şef-MLV kompleksleri görüntülerini temsilcisi Floresan Mikroskobu. (A). örnek olarak küresel bir şef. Şef MLV için bağlı bir yarımküre şeklinde görünür. (B). örnek olarak dalgalı bir şef. Siyah okları membran deforme alanları belirtir. Görüntü gelişmiş ve fluorescently etiketli Şef membranlar görselleştirme geliştirmek için ters. Ölçek çubuğu 5 µm. temsil eden <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig2.jpg"> Resim 2 : Şef-MLV hazırlık ve mikroenjeksiyon düzenleri şematik çizimler. (A). Kuru lipit katmanı kloroform lipid çözümden döner buharlaşma sonucu cam şişe dibinde oluşturulur. (B). rehydrated lipit katmanı sonicated ve küçük lipid veziküller kurdu. (C). vezikül çözüm (5 µL) küçük bir damlacık bir cam kapak kayma yüzeyine yerleştirilen ve lipid çözüm kurutmak ve (Bu adım gösterilmez) bir kuru lipid film oluşturmak için bir desiccator 20 dk için transfer. Tampon çözeltinin 50 µL kuru lipid filmle nemlendirilmesi önceden biçimlendirilmiş Şef-MLV kompleksler oluşturur. (D). önceden biçimlendirilmiş kompleksleri aktarım arabellek sonuçları seyrek ayrılmış Şef-MLVs oluşumunda daha büyük bir hacim için cam kapak kayma yüzeyine bağlı. (E). micropipette Şef yüzeye yakın konumlandırma ve kalsiyum iyonları serbest MTPs oluşumunu tetikler. Resimler çizilmez ölçek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig3.jpg"> Şekil 3 : Kalsiyum iyonları mikroenjeksiyon için deneysel Kur. (A). deneysel kurulumunun MTPs GUVs içinde oluşturmak için gereken bileşenleri. (B). mikroenjeksiyon kurulum ayrıntılarını. Cam coverslip Şef-MLV kompleksleri çözüm ile mikroskop sahne alanı'nda yerleştirilir. 30 ° (beyaz işaretli) micropipette ve cam kapak kayma yüzeyi arasındaki açıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig4.jpg"> Şekil 4 : MTPs üzerine mikroenjeksiyon Şef yüzeyinde kalsiyum iyonlarının oluşumu. (A). Şef-MLV karmaşık bir kalsiyum iyon degrade maruz önce. Şef entrapped lipid vezikül ok gösterir ve hangi gözlem MTPs. (B) engel değil. Küçük MTPs mikroenjeksiyon kalsiyum iyonlarının (CaCl2 micropipette 5 mM konsantrasyonu) üzerine oluşur. (C). kalsiyum iyonları için sürekli maruz üzerine MTPs büyüme. Floresan görüntü gelişmiş ve görselleştirme amaçlar için ters. Ölçek çubuğu 5 µm. temsil eden <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig5.jpg"> Şekil 5 : Cam kalsiyum iyon mikroenjeksiyon için kullanılan Mikropipetler. (A). düzgün işleyen bir micropipette örneği. (B). ucu kırık (hasarlı bölgeyi siyah bir ok ile gösterilen) sahip bir micropipette örneği. Her iki görüntü gelişmiş ve daha iyi görselleştirme için ters. Ölçek çubuğu 5 µm. temsil eden <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig6.jpg"> Şekil 6 : Kalsiyum iyon güdümlü tercümesi Şef yüzeyi çevresine MTPs. (A). MTPs mikroenjeksiyon 5 mm CaCl2 çözüm üzerine Şef yüzeyde oluşan. (B-C). Micropipette ipucu tercümesi (0,2-0,3 mikron/s) membran yüzey MTPs kalsiyum İyon kaynağı yönünde hareket tetikler. Siyah okları micropipette hareket yönü vurgulamak. Görüntü gelişmiş ve membran görselleştirme geliştirmek için ters. Ölçek çubuğu 5 µm. temsil eden <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig7.jpg"> Şekil 7 : Yüksek çeviri hızında micropipette ipucu MTPs. (A). MTPs mikroenjeksiyon 5 mm CaCl2 çözüm (beyaz çizgi) üzerine Şef yüzeyde oluşan. (B-C). Micropipette Şef yüzeyi (1 mikron/s) çevresine yüksek çeviri oranında daha önce kurulan MTPs (beyaz çizgi) saçılma yanı sıra micropipette uç (kırmızı çizgi), yeni konumda yeni MTPs oluşumu sonuçlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57789/57789mov1.jpg"> Takıma giren film 1: MTPs oluşumu içinde Şef Ca için yerelleştirilmiş maruz üzerine 2 + gradyan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/Lobovkina_Movie_1.avi" target="_blank">Bu film indirmek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57789/57789mov2.jpg"> Takıma giren film 2: Kalsiyum iyon güdümlü MTP geçiş Şef yüzeyi çevresine.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/Lobovkina_Movie_2.avi" target="_blank">Bu film indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients at JoVE.com

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

Yanıt olarak lokalize kalsiyum iyon degradeler dev veziküller membran Remodeling

Biz bir teknik veziküller, temassız embriyolardan için yerelleştirilmiş kalsiyum iyon degradeler kullanarak mevcut. Bir dev lipid vezikül, çevresinde bir kalsiyum iyon eriyik mikroenjeksiyon membran borulu çıkıntılar üretiminde kaynaklanan lipit membran yeni model için kullanılmaktadır.

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

membrane-remodeling-giant-vesicles-response-to-localized-calcium-ion

Research

JoVE Journal

Chemistry

7.9K Görüntüleme.  Chalmers University of Technology. Biz bir teknik veziküller, temassız embriyolardan için yerelleştirilmiş kalsiyum iyon degradeler kullanarak mevcut. Bir dev lipid vezikül, çevresinde bir kalsiyum iyon eriyik mikroenjeksiyon membran borulu çıkıntılar üretiminde kaynaklanan lipit membran yeni model için kullanılmaktadır.

Video: Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

Biyofiziksel Özellikleri ve İşlevleri İncelemek için Membranlarda Septin Düzeneğinin Yeniden Sulandırılması

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Biyokimya

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 complex in the ER membrane provides an aqueous path for newly-synthesized polypeptides into the lumen of the ER. Recent work from various laboratories suggested that this heterotrimeric complex may also form transient Ca2+ leak channels2-8. The key observation for this notion was that release of nascent polypeptides from the ribosome and Sec61 complex by puromycin leads to transient release of Ca2+ from the ER. Furthermore, it had been observed in vitro that the ER luminal protein BiP is involved in preventing ion permeability at the level of the Sec61 complex9,10. We have established an experimental system that allows us to directly address the role of the Sec61 complex as potential Ca2+ leak channel and to characterize its putative regulatory mechanisms11-13. This system combines siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging13. Cells are treated with siRNAs that are directed against the coding and untranslated region (UTR), respectively, of the SEC61A1 gene or a negative control siRNA. In complementation analysis, the cells are co-transfected with an IRES-GFP vector that allows the siRNA-resistant expression of the wildtype SEC61A1 gene. Then the cells are loaded with the ratiometric Ca2+-indicator FURA-2 to monitor simultaneously changes in the cytosolic Ca2+ concentration in a number of cells via a fluorescence microscope. The continuous measurement of cytosolic Ca2+ also allows the evaluation of the impact of various agents, such as puromycin, small molecule inhibitors, and thapsigargin on Ca2+ leakage. This experimental system gives us the unique opportunities to i) evaluate the contribution of different ER membrane proteins to passive Ca2+ efflux from the ER in various cell types, ii) characterize the proteins and mechanisms that limit this passive Ca2+ efflux, and iii) study the effects of disease linked mutations in the relevant components.

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

The endoplasmic reticulum plays a key role in protein biogenesis and in calcium homeostasis. We have established an experimental system that allows us to address the role of Ca2+ leak channels and to characterize their putative regulatory mechanisms. This system involves siRNA mediated gene silencing and live cell Ca2+ imaging.

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar 2 + ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Biyoloji

Spontaneous Formation and Rearrangement of Artificial Lipid Nanotube Networks as a Bottom-Up Model for Endoplasmic Reticulum

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense lipidic nanotubes that are, in terms of morphology and dynamics, reminiscent of ER. The networks are derived from phospholipid double bilayer membrane patches adhering to a transparent Al2O3 substrate. The adhesion is mediated by Ca2+ in the ambient buffer. Subsequent depletion of Ca2+ by means of BAPTA/EDTA causes retraction of the membrane, resulting in spontaneous lipid nanotube network formation. The method only comprises phospholipids and microfabricated surfaces for simple formation of an ER model and does not require the addition of proteins or chemical energy (e.g., GTP or ATP). In contrast to the 3D morphology of the cellular endoplasmic reticulum, the model is two-dimensional (albeit the nanotube dimensions, geometry, structure, and dynamics are maintained). This unique in vitro ER model consists of only a few components, is easy to construct, and can be observed under a light microscope. The resulting structure can be further decorated for additional functionality, such as the addition of ER-associated proteins or particles to study transport phenomena among the tubes. The artificial networks described here are suitable structural models for the cellular ER, whose unique characteristic morphology has been shown to be related to its biological function, whereas details regarding formation of the tubular domain and rearrangements within are still not completely understood. We note that this method uses Al2O3 thin-film-coated microscopy coverslips, which are commercially available but require special orders. Therefore, it is advisable to have access to a microfabrication facility for preparation.

Solid-supported, protein-free, double phospholipid bilayer membranes (DLBM) can be transformed into complex and dynamic lipid nanotube networks and can serve as 2D bottom-up models of the endoplasmic reticulum.

Kendiliğinden oluşumu ve endoplazmik retikulum için aşağıdan yukarıya Model olarak yapay Lipid nanotüp ağların düzenlenmesi

We present a convenient method to form a bottom-up structural organelle model for the endoplasmic reticulum (ER). The model consists of highly dense ...

Biyomühendislik

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Nörobilim

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent Ca2+ indictors have become popular. Here we demonstrate TED (= targeted-esterase induced dye loading), a method to improve the release of Ca2+ indicator dyes in the ER lumen of different cell types. To date, TED was used in cell lines, glial cells, and neurons in vitro. TED bases on efficient, recombinant targeting of a high carboxylesterase activity to the ER lumen using vector-constructs that express Carboxylesterases (CES). The latest TED vectors contain a core element of CES2 fused to a red fluorescent protein, thus enabling simultaneous two-color imaging. The dynamics of free calcium in the ER are imaged in one color, while the corresponding ER structure appears in red. At the beginning of the procedure, cells are transduced with a lentivirus. Subsequently, the infected cells are seeded on coverslips to finally enable live cell imaging. Then, living cells are incubated with the acetoxymethyl ester (AM-ester) form of low-affinity Ca2+ indicators, for instance Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, or Mag-Fura2-AM. The esterase activity in the ER cleaves off hydrophobic side chains from the AM form of the Ca2+ indicator and a hydrophilic fluorescent dye/Ca2+ complex is formed and trapped in the ER lumen. After dye loading, the cells are analyzed at an inverted confocal laser scanning microscope. Cells are continuously perfused with Ringer-like solutions and the ER calcium dynamics are directly visualized by time-lapse imaging. Calcium release from the ER is identified by a decrease in fluorescence intensity in regions of interest, whereas the refilling of the ER calcium store produces an increase in fluorescence intensity. Finally, the change in fluorescent intensity over time is determined by calculation of &Delta;F/F0.

Direct Imaging of ER Calcium with Targeted-Esterase Induced Dye Loading TED

Targeted-esterase induced dye loading (TED) supports the analysis of intracellular calcium store dynamics by fluorescence imaging. The method bases on targeting of a recombinant Carboxylesterase to the endoplasmic reticulum (ER), where it improves the local unmasking of synthetic low-affinity Ca2+ indicator dyes in the ER lumen.

Hedefli-esteraz ile ER Kalsiyum Doğrudan Görüntüleme Kaynaklı Boya Yükleme (TED)

Visualization of calcium dynamics is important to understand the role of calcium in cell physiology. To examine calcium dynamics, synthetic fluorescent ...

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly understood. Here assays are described to monitor the ability and kinetics of healing of cultured cells following localized injury. The first protocol describes an end point based approach to simultaneously assess cell membrane repair ability of hundreds of cells. The second protocol describes a real time imaging approach to monitor the kinetics of cell membrane repair in individual cells following localized injury with a pulsed laser. As healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of injury, the third protocol describes the use of above end point based approach to assess one such trafficking event (lysosomal exocytosis) in hundreds of cells injured simultaneously and the last protocol describes the use of pulsed laser injury together with TIRF microscopy to monitor the dynamics of individual subcellular compartments in injured cells at high spatial and temporal resolution. While the protocols here describe the use of these approaches to study the link between cell membrane repair and lysosomal exocytosis in cultured muscle cells, they can be applied as such for any other adherent cultured cell and subcellular compartment of choice.

The process of healing injured cells involves trafficking of specific proteins and subcellular compartments to the site of cell membrane injury. This protocol describes assays to monitor these processes.

Görüntüleme Hücre Membran Hasarı ve Onarımı ilgilendim hücrealtı Süreçleri

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Bir transmembran proteinin yeniden oluşturulması, Mikroskop ve yama kelepçe Çalışmaları Dev tek-katmanlı keseler içine Voltaj kapılı iyon kanalı, KvAP,

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

Membran nanotüpler dev Unilamellar veziküller çekerek

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Pinching-off of Coated Vesicles

Vesicle budding is orchestrated by distinct cytosolic proteins such as adaptor proteins, coat proteins, and GTPases. To initiate vesicle budding, membrane-bending proteins containing crescent-shaped BAR domains bind to the lipid heads in the bilayer and distort the membrane to form a protein-coated vesicle bud. Adaptors proteins such as AP2 for clathrin-coated vesicles can nucleate on the deformed membrane. Finally, coat proteins such as clathrin or COPI and COPII assemble into a coat forming the coated vesicle.
COP-coated vesicles bud off their organelle membrane with the help of several small GTPases such as SEC, SAR, and ARF proteins. On the other hand, Clathrin-coated vesicles require additional proteins, the most important of which is Dynamin. Dynamin is a GTPase of about 100-kDa that assembles as helical spirals at the necks of vesicle buds. It undergoes a GTP hydrolysis-driven conformational change that results in a twisting motion, which detaches the clathrin-coated vesicle from the membrane.
Once a vesicle buds, it immediately sheds its coat. The energy required for uncoating the clathrin coat is derived through ATP hydrolysis by Hsp70 chaperone protein, an ATPase activated by a co-chaperone named auxin. Auxilin binds Hsp70 and guides it to appropriate locations on the clathrin lattice to stimulate ATP hydrolysis. Auxilin binding creates a detectable distortion in the clathrin coat. It simultaneously contacts another clathrin at its terminal domain, recruiting more Hsc70 to the neighborhood, thus uncoating the entire vesicle. Tight control of vesicular coat formation and shedding facilitates the timing of vesicle budding and fusion with the target membrane.

Kaplanmış Veziküllerin Sıkışması

Vesicle budding is orchestrated by distinct cytosolic proteins such as adaptor proteins, coat proteins, and GTPases. To initiate vesicle budding, ...

Education

JoVE Core

Hücre Biyolojisi

Unit 1

Hücre içi Membran Trafiği

KEY TERMS AND CONCEPTS

Fusion of Secretory Vesicles with the Plasma Membrane

Proteins and neurotransmitters in secretory vesicles can be released from a cell upon vesicle docking, priming, and fusion with the plasma membrane. Vesicles are docked and primed in preparation for the quick exocytosis of their contents in response to a stimulus. The fusion process is mainly carried out by a SNAP Receptor or SNARE complex, consisting of synaptobrevin, syntaxin-1, and SNAP-25.
In 1993, Jim Rothman proposed that the antiparallel pairing of vesicular and transmembrane SNAREs, or v- and t-SNAREs, was essential for vesicle docking. However, more recently, it has been shown that vesicle docking can also occur without SNAREs. Additionally, two soluble proteins,&#160; N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein (NSF) and soluble NSF attachment proteins (SNAP), bind to the SNARE complex to facilitate fusion.
The v-and t-SNAREs partially fuse in the priming process, forming a fusion-ready state. The protein complexin (Cpx) clamps the SNAREs and holds the vesicles in this partially fused state to prevent premature exocytosis. Vesicular membrane fusion begins when a stimulus, such as an action potential at the axonal terminal of a neuron, opens up a calcium channel, and calcium enters the cell. A total of five calcium ions bind to each synaptotagmin (Syt) &#8211; a vesicular membrane protein on either side of the vesicle. Calcium-bound Syt releases the Cpx clamp from the SNARE complexes and opens up the fusion pore to release the neurotransmitter. After fusion, NSF and SNAP proteins disassemble SNARE complexes for recycling.
Bacterial neurotoxins, such as botulinum from Clostridium botulinum or tetanus from Clostridium tetani, can inhibit secretory vesicle fusion by damaging the SNARE proteins, which prevents the fusion of secretory vesicles with the neuronal plasma membrane. As neurotransmitters are not released, action potentials are not generated, causing paralysis of muscles, and in some cases, death.

Salgı Veziküllerinin Plazma Membranı ile Füzyonu

Proteins and neurotransmitters in secretory vesicles can be released from a cell upon vesicle docking, priming, and fusion with the plasma membrane. ...

Yanıt olarak lokalize kalsiyum iyon degradeler dev veziküller membran Remodeling

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler