Bu eser bir Norwich araştırma Park öğrencilik (JR) tarafından desteklenen, ortak mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi/Biotechnological ve OpenPlant Sentetik Biyoloji Araştırma Merkezi Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi BBSRC tarafından finanse edilen hibe (BB / L014130/1) (M.J.S., A.O.); John Innes merkezi bilgi değişimi ve ticarileştirme vermek (BB/KEC1740/1) (BB); ve BBSRC Enstitüsü Stratejik programı Grant 'Molekülleri doğadan' (1/P012523/BB) ve John Innes Vakfı (Ao). George pEAQ vektörler sağlamak için Lomonossoff ve Andrew Davis Fotoğrafçılık için teşekkür etmek istiyorum.

<ol>
	<li>Thimmappa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triterpene+biosynthesis+in+plants.">Triterpene biosynthesis in plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 65, 225-257 (2014).</li><li>Seki, H., Tamura, K., Muranaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P450s+and+UGTs:+Key+players+in+the+structural+diversity+of+triterpenoid+saponins.">P450s and UGTs: Key players in the structural diversity of triterpenoid saponins.</a> Plant Cell Physiology. 56 (8), 1463-1471 (2015).</li><li>Roy, A., Saraf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limonoids:+overview+of+significant+bioactive+triterpenes+distributed+in+plants+kingdom.">Limonoids: overview of significant bioactive triterpenes distributed in plants kingdom.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 29 (2), 191-201 (2006).</li><li>Kamble, S. M., Goyal, S. N., Patil, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+pentacyclic+triterpenoids+as+adjuvants+in+cancer+chemotherapy:+a+review.">Multifunctional pentacyclic triterpenoids as adjuvants in cancer chemotherapy: a review.</a> RSC Advances. 4 (63), 33370-33382 (2014).</li><li>Liby, K. T., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+oleanane+triterpenoids:+multifunctional+drugs+with+a+broad+range+of+applications+for+prevention+and+treatment+of+chronic+disease.">Synthetic oleanane triterpenoids: multifunctional drugs with a broad range of applications for prevention and treatment of chronic disease.</a> Pharmacological Reviews. 64 (4), 972-1003 (2012).</li><li>Yadav, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+inflammatory+pathways+by+triterpenoids+for+prevention+and+treatment+of+cancer.">Targeting inflammatory pathways by triterpenoids for prevention and treatment of cancer.</a> Toxins. 2 (10), 2428-2466 (2010).</li><li>Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ginsenosides+chemistry,+biosynthesis,+analysis,+and+potential+health+effects.">Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects.</a> Advances in Food and Nutrition Research. 55, 1-99 (2009).</li><li>Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+synthetic+biology+platform+for+rapid+access+to+gram-scale+quantities+of+novel+drug-like+molecules.">A translational synthetic biology platform for rapid access to gram-scale quantities of novel drug-like molecules.</a> Metabolic Engineering. 42, 185-193 (2017).</li><li>Andersen-Ranberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+landscape+of+diterpene+structural+diversity+through+stereochemically+controlled+combinatorial+biosynthesis.">Expanding the landscape of diterpene structural diversity through stereochemically controlled combinatorial biosynthesis.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (6), 2142-2146 (2016).</li><li>Peyret, H., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pEAQ+vector+series:+the+easy+and+quick+way+to+produce+recombinant+proteins+in+plants.">The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants.</a> Plant Molecular Biology. 83, 51-58 (2013).</li><li>Sainsbury, F., Thuenemann, E. C., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pEAQ:+versatile+expression+vectors+for+easy+and+quick+transient+expression+of+heterologous+proteins+in+plants.">pEAQ: versatile expression vectors for easy and quick transient expression of heterologous proteins in plants.</a> Plant Biotechnology Journal. 7 (7), 682-693 (2009).</li><li>Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extremely+high-level+and+rapid+transient+protein+production+in+plants+without+the+use+of+viral+replication.">Extremely high-level and rapid transient protein production in plants without the use of viral replication.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1212-1218 (2008).</li><li>Voinnet, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enhanced+transient+expression+system+in+plants+based+on+suppression+of+gene+silencing+by+the+p19+protein+of+tomato+bushy+stunt+virus.">An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus.</a> The Plant Journal. 33 (5), 949-956 (2003).</li><li>Holtz, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commercial-scale+biotherapeutics+manufacturing+facility+for+plant-made+pharmaceuticals.">Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals.</a> Plant Biotechnology Journal. 13 (8), 1180-1190 (2015).</li><li>Bucar, F., Wubea, A., Schmidb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+product+isolation+-+how+to+get+from+biological+material+to+pure+compounds.">Natural product isolation - how to get from biological material to pure compounds.</a> Natural Product Reports. 30, 525-545 (2003).</li><li>Kaufmann, B., Christen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+extraction+techniques+for+natural+products:+microwave-assisted+extraction+and+pressurised+solvent+extraction.">Recent extraction techniques for natural products: microwave-assisted extraction and pressurised solvent extraction.</a> Phytochemical Analysis. 13 (2), 105-113 (2002).</li><li>Larsen, E., Christensen, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+saponification+method+for+the+quantitative+determination+of+carotenoids+in+green+vegetables.">Simple saponification method for the quantitative determination of carotenoids in green vegetables.</a> Journal of Archaeological and Food Chemistry. 53 (17), 6598-6602 (2005).</li><li>Sainsbury, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+virus-derived+system+to+manipulate+plant+natural+product+biosynthetic+pathways.">Using a virus-derived system to manipulate plant natural product biosynthetic pathways.</a> Methods Enzymology. , 185-202 (2012).</li><li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination.">DNA Cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Research. 10, 1788-1795 (2000).</li><li>Ting, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNARE-RNAi+results+in+higher+terpene+emission+from+ectopically+expressed+caryophyllene+synthase+in+Nicotiana+benthamiana.">SNARE-RNAi results in higher terpene emission from ectopically expressed caryophyllene synthase in Nicotiana benthamiana.</a> Molecular Plant. 8, 454-466 (2015).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+production+of+artemisininin+in+Nicotiana+benthamiana+is+boosted+by+a+specific+lipid+transfer+protein+from+A.+annua.">Transient production of artemisininin in Nicotiana benthamiana is boosted by a specific lipid transfer protein from A. annua.</a> Metabolic Engineering. 38, 159-169 (2016).</li><li>Nielsen, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redirecting+photosynthetic+reducing+power+toward+bioactive+natural+product+synthesis.">Redirecting photosynthetic reducing power toward bioactive natural product synthesis.</a> ACS Synthetic Biology. 2, 308-315 (2013).</li><li>Dong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoterpene+biosynthesis+potential+of+plant+subcellular+compartments.">Monoterpene biosynthesis potential of plant subcellular compartments.</a> New Phytologist. 209, 679-690 (2016).</li><li>Ferrero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+and+morphogenesis+of+the+endoplasmic+reticulum+driven+by+the+membrane+domain+of+3-hydroxy-3-methylglutaryl+Coenzyme+A+reductase+in+plant+cells.">Proliferation and morphogenesis of the endoplasmic reticulum driven by the membrane domain of 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A reductase in plant cells.</a> Plant Physiology. 168, 899-914 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yerine aracılığıyla yüksek vakum infiltrasyon rutin olarak bizim laboratuvar olarak çeşitli aşağı akım uygulamaları için ilgi triterpen bileşiklerin partiye hazırlık üretimi için kullanılan için bu iletişim kurallarını sağlar. Burada açıklanan vakum infiltrasyon aparatı kolayca çoğaltılır. Ayrıca vakum baraj gölünün sadece infiltrasyon odası olarak değiştirilmemiş bir vakum fırını repurpose mümkündür ancak gerekli vakum çekmek için gereken süreyi azaltmak için tavsiye edilir. Vakum Pompası uygun bir kondansatör ilavesi ile korumak teorik olarak mantıklı değil, ama bizim laboratuvarda bunun gereksiz olduğunu bulduk.
Yaprakları tamamen infiltrasyon süspansiyon dalmış değil eğer infiltrasyon kapsama güvenilir değil. Bu sorun süspansiyon seviyesi üst yüzeyi bitki sahibinin ulaşır ve bitki sahibi infiltrasyon banyo için sıkı bir seçimdir sağlayarak küçültülür. Şekil 2 ' den bitki sahibinin üst yüzeyi içinde yer ne zaman infiltrasyon banyo için gömme olduğunu unutmayın. Bu paneller infiltrasyon banyo üst bağlantı noktasını oluşturan orta kenarları sahibinin tarafından sağlanır. İnfiltrasyon süspansiyon süspansiyon düzeyde tutmak için dönemsel eklemeler gerektirir. Bu en iyi OD600 kademeli azaltma büyük bir batch-wise infiltrasyon boyunca önlemek için aşırı infiltrasyon süspansiyon eklenmesiyle elde edilir. Bu soruşturma quantitively henüz rağmen ancak, bizim ellerimizde ikame su için partiye hazırlık bir ölçekte, göze çarpan etkisi beklenen verimi için görünmüyor. Kaç bitkiler infiltrasyon süspansiyon bir toplu işleminden sızmış hala açık bir soru var. Biz düzenli olarak tek bir toplu iş infiltrasyon süspansiyon, 100 ve 200 bitkilerle arasında sızmak. Buna ek olarak, bazı toprak sızma süspansiyon infiltrasyon işlemi boyunca leach normaldir. Bu infiltrasyon etkinliği üzerinde fark edilebilir bir etkisi için bulunamamıştır.
Hasat sırasında tavsiye (ama kritik değil) sadece sızmış yaprakları toplamaya (biraz yaprak sonrası infiltrasyon büyüdü). Seçici hasat ile Aksi takdirde endojen kirleri göre bileşik faiz oranını artıracak verimsiz doku seyreltme engeller. Bu aşağı akım arıtma kolaylığı nominal bir etkisi vardır ve bu işlemlerin ölçeğini artırır. THMGR habercisi kaynağı artırmak için kullanırken, necrosed bir fenotip sonrası infiltrasyon büyüme döneminde geliştirmek için sık sık görülmektedir. Bu normaldir ve aslında seçici hasat ve aşağı akım kurutma işlemi yardımcı olur. Kurutulmuş yaprak toz genellikle serin, Kuru ve karanlık bir yerde, ama ideal bir desiccator vakum altında kapalı bir kap içinde saklanır. Bu bileşik baktılar istikrar üzerinde bağlıdır. -80 ° C buzlukta saklamak için tercih eğer dikkatli olun. Kurutulmuş sağlamak yapraklar su geçirmez bir kap içinde ve kaldırma depolama, oda sıcaklığında açılış öncesinde ısıtmak için bu kapsayıcıdaki izin. Aksi halde aşağı-stream işleme engelleyen yaprakları, rewetting neden olur.
Bu iletişim kuralı hasat sonrası adımlarda görsel amacıyla sağlanmaktadır ve yardım etmek için pratik Kimya sınırlı olabilir bu araştırmacılar deneyim. Onlar birçok diğer doğal ürün çıkarma/arıtma teknik yedek olabilir. Ayrıntılı olarak giriş, PSE pek çok avantajı vardır, ancak sermaye piyasada bulunan PSE cihazları mal engelleyici olabilir ve gerekli değil. Temel iyon değiştirme reçine tedavi geleneksel sabunlaşma sıvı/sıvı bölümleme tarafından takip değiştirmek için çok uygun bir yöntemdir. Ancak, karboksilik asit grubu veya esterleri gibi temel koşullar altında hidrolize fonksiyonel gruplar içeren ürünler için uygun değildir. Bu ürünler üzerinde temel iyon değiştirme reçine korunabilmesi için beklenir. Ancak, bu bir yakalama için yararlanmak ve yordam (burada belgelenen değil) serbest bırakmak için potansiyel olduğunu. Geleneksel sabunlaşma uygun olacağını nerede temel iyon değiştirme reçine tedavi uygun bir alternatif hizmet vermektedir. Adım 9, açıklanan Kromatografi yöntemi Şekil 3' te açıklanan bileşikler için genelleştirilebilir olmak bulunmuştur. Ancak, artan polarite bileşikleri uzun bir % 100 etil asetat elüsyon süre gerektirebilir. Adım 9.2, referansla aşağı akım iyi arıtma tamamen bileşik özeldir ve aynı zamanda ölçekte bağlıdır. En iyi duruma getirilmiş degradelerle daha küçük ölçekli flash Kromatografi tekrarlanan tur bir saflık NMR analizi için uygun ulaşmak için genellikle yeterli. Daha büyük ölçeklerde kristalizasyon kez uygun bir alternatiftir. Zor durumlarda, partiye hazırlık veya yarı partiye hazırlık yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) izole bileşik istenen miktarı bağlı olarak istihdam edilebilir. Aşağı akım arıtma işlemleri için temsilci bileşikleri bir dizi örnekleri8başka bir yerde bulunabilir.
Geçerli protokol, burada anlatılan gibi bizim laboratuarda rutin olarak kullanılan ve yardımcı programı kanıtlamıştır. Ancak, daha fazla en iyi duruma getirme ifade platformu için hala önemli kapsam vardır. Nasıl daha fazla yolu mühendislik araştırmak için bizim laboratuvar çalışmalar sürmektedir ve protein ifade düzeyleri fark kontrolünü toksisite konak hücreleri için arabuluculuk sırasında triterpen üretim daha da artırabilirsiniz. Ayrıca hücre içi taşıma sistemleri20,21manipülasyon ve enzimler artırabilirsiniz yolları farklı hücresel kompartmanlarda22,23, yönünü araştırmak için potansiyel mevcuttur birden çok oksidasyon olayı verimliliği. Anahtar organelleri temel morfolojisi değiştirme için potansiyel yararları da keşfedilmeyi. Örneğin, Arabidopsis thaliana HMGR membran etki alanının overexpression bitkiler24endoplazmik retikulum hipertrofisi ikna etmek için gözlenen; CYP450 etkinliği için önemli bir site. Bu iletişim kuralı ideal miligram triterpen ürünler miktarlarda gram-ölçek için üretimi için uygundur ve bir araştırma ortamda bileşikleri aşağı akım çalışma (Örneğin, sistematik araştırma yapısı-faaliyet için erişmek için istihdam edilecek ilişkiler ve farmakokinetik ve farmakodinamik özellikleri için ön soruşturma kurşun bileşikleri klinik ilgi). Ancak, doğrusal bir platformdur ve güvenilir bir şekilde ölçeklenebilir yeterlidir numarası kullanılan bitkilerin ve agroinfiltration üzerinden geçici ifade pratiklik artırarak ilaç proteinleri için endüstriyel ölçekte gösterilmiştir 14, böylece orada potansiyel yüksek değerli triterpeneler ticari üretimi için genişletilmesi bu platform için. Alternatif olarak, kesinleşmiş arzu multigene biyosentetik yol gidiyorsun, toplu işleme izin sağlam transformants üretim hayal etmek mümkün ve devam eden 'Transgenik i. benthamiana Tarım' da suşları ticari değeri farklı bileşikler üreten.

Triterpeneler en büyük ve bitki doğal ürünlerin çoğu yapısal olarak farklı aileler vardır. Onların büyük çeşitlilik rağmen tüm triterpen doğal ürünler aynı doğrusal habercisi 2,3-oxidosqualene, bitkilerde mevalonate yolun bir ürün türetilen inanılıyor. 2,3-oxidosqualene cyclization başlatılan ve bir aile oxidosqualene cyclases (OSCs) olarak adlandırılan enzimler tarafından kontrol edilir. Bu cyclization adım doğa1' den bildirilen farklı triterpen iskele yüzlerce çeşitlendirme, ilk düzeyini temsil eder. Bu iskele daha da dahil ancak bununla sınırlı olmamak üzere, sitokrom p450s (CYP450s)1,2enzimler uyarlayarak çeşitlendirilmiş. Biyosentetik böyle yolları bazen üst triterpen zar zor tanınabilir olan son ürünleri sonuçlanan büyük karmaşıklık yol açabilir. Örneğin, güçlü böcek ve antifeedant limonoid azadirachtin karmaşık yapısını tirucallane tür3bir tetracyclic triterpen türetmek için inanılır.
Birçok triterpen elde edilen doğal ürünler, nispeten değiştirilmemiş üst iskele, hatta olanlar medicinally ilgili biyolojik etkinlik4,5,6,7sahip gösterilmiştir. Ancak, şu ana kadar bu potansiyeli triterpen türevi ilaçlar klinikte bir bolluk içine çevrilmiş olmayışıdır. Belki bu (en azından kısmen) sınırlı pratik sentetik erişim için bu sınıfa bileşik bir sonucu yapısı-etkinlik ilişkiler keşif ve gelişimi bastırmak bir sorun kurşun, adaylar tarafından geleneksel tıbbi Kimya iş akışları.
İ. benthamiana yaprakları diğer bitki tür triterpen biyosentetik enzimlerin geçici ifade 2,3-oxidosqualene yeni yüksek değerli triterpen ürünleri (Şekil 1) doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Bu işlem işlevsel olarak karakterize aday enzimler ve önemli doğal olarak meydana gelen metabolitleri biyosentetik yolları yeniden oluşturmak için kullanılabilir. Aynı şekilde, o da birleşimsel biyosentetik yaklaşımlar roman triterpen ürünler, yapısal olarak ilgili analogları, sistematik araştırma yapısı-aktivite ilişkileri izin kitaplıklarda neden olabilir bir strateji üretmek için yararlanılabilir 8,9biyolojik olarak aktif kurşun bileşikleri.
Agroinfiltration i. benthamiana yaprakları geçici ifade ulaşmada etkin ve basit bir yoludur. İşlem yaprakları infiltrasyonu ile ikili ifade construct(s) ilgi taşıyan A. tumefaciens süspansiyon içerir. Bu hücreler arası uzayda Hava yerinden ve eski yerine koymak o ile A. tumefaciens süspansiyon stoma bantlı yoluyla sıvı zorlar basınç uygulanması yoluyla elde edilir. Bakteri ilgili T-DNA'lar bitki hücrelerinin infiltre yaprak doku ifadede yerelleştirilmiş ve geçici protein sonuçlanan iç transfer.
Transgenik bitkiler üretme geçici ifade için istihdam için herhangi bir ikili vektör uygun biz börülce mozaik virüsü CPMV elde edilen Hypertranslational (HT) protein ifade sistem10, kullanmak 11. bu sistemde faiz gen çevrilmeyen bölgeler (UTR) CPMV RNA-2 üzerinden tarafından çevrili olduğunu. 5' UTR viral çoğaltma12üzerinde hiçbir güven ile protein çeviri çok yüksek düzeyde kaynaklanan değişiklikler içerir. Bu teknik siteye özgü rekombinasyon Protokolü uyumlu yapıları (pEAQ -HT- DEST)10,11klonlama içerir kolay ve hızlı (pEAQ) ikili vektör serisi geliştirilmiştir. Çoğu pEAQ vektörler de bir domates gür dublör virüs kaynaklı P19 silencing baskılayıcı gen13 ayrı bir P19 taşıyan yük coinfiltrate gerek kaçınmanızı sağlar ve çok affords ifade kaset T-DNA bölümü içinde içerir üst düzey protein ifade ana bitki hücre10,11.
İ. benthamiana bir ifade ana bitki biyosentetik yolları ile çalışırken belirli avantajları olduğu gibi kullanın. Hücre mimarisi özünde uygun mRNA ve protein işleme ve ek olarak gerekli Co enzim, redüktaz (için CYP450s) ve metabolik değişimler haiz uygun bölmelere destekler. Fotosentez karbon kaynağıdır; Böylece, bitkiler sadece kaliteli kompost, sadece su, CO2 (havadan) ve güneş ışığı girişleri gerektiren içinde yetiştirilen olabilir. Bu uysalca büyük multigene ifade oluşturmak gerek inkâr A. tumefaciens, farklı suşları Co infiltrasyonu tarafından elde edilebilir gibi platform da son derece farklı kombinasyonlar proteinlerin, ortak ifade için uygundur kaset. Ayrıca, süreç sürekli ve güvenilir bir şekilde yalnızca denemede kullanılan bitkiler sayısını artırarak ölçeklendirilebilir.
Önceki bizim laboratuvar çalışmalarında yardımcı programı bu platformun partiye hazırlık ölçekli deneyler için göstermiştir. Bu roman triterpeneler hazırlık bioactivity deneyleri ve ölçek için kadar izole ürün gram miktarda elde etmek için dahil. Ayrıca, hànzú triterpen ürünlerin birikimi arttı birkaç bir redüktaz (tHMGR), hızı sınırlaması bir N-terminal-kesme, geribildirim-duyarlı şeklinde 3-hidroksi, 3-methyglutary-koenzim ortak ifade tarafından katlayın ters yönde enzim mevalonate yolu8.
Yetenek kolayca yukarı ölçekli infiltrasyon işlemi tür hazırlık ölçekli deneyler anahtarıdır. Tipik bir deneyde, onlarca yüzlerce bitkilerin izole ürünün hedef miktarını elde etmek için gerekli olabilir. Tek tek yaprakları elle infiltre (gereksiz kullanarak) operasyonel zorlu ve genellikle çok zaman alıcı, bu yöntem rutin ölçek-up için pratik oluşturma. Operatör beceri seviyesine bağlı değildir ve yaprak yüzeyinde daha büyük bir alanı infiltrasyonu sağlar gibi vakum infiltrasyon el infiltrasyon, avantaj sunar. Bu yordam ticari ilaç proteinler14büyük ölçekli üretim için kullanılır. Bu iletişim kuralı piyasada bulunan parçalar inşa edilebilir bir kolayca yinelenebilir vakum infiltrasyon aparat kullanır. Bu 4 bitkiler, hızlı ve pratik batch-wise infiltrasyonu bitkiler yüzlerce kısa bir süre içinde saglayan eşzamanlı infiltrasyonu sağlar (Şekil 2a -2b). Vakum infiltrasyon aparatı infiltrasyon odası (Şekil 2f) formları bir vakum fırından oluşur. Fırın bir pompa vakum su deposu üzerinden bağlanır. Bu büyük ölçüde infiltrasyon odası istenen boşlukta ulaşmak için gereken süreyi azaltır. Bitki bir ısmarlama sahibi güvenli ve A. tumefaciens süspansiyon ile dolu bir 10 L paslanmaz çelik su banyosu içine ters (Şekil 2a -2 c). Bitkiler hava parçaların komple daldırma için verimli infiltrasyon önemlidir. Su banyosu sonra infiltrasyon odası içinde yerleştirilir (Şekil 2B -2e) ve hava yaprak interstisyel alanlarda dışarı çekmek için uygulanan vakum. Basınç 880 mbar (yaklaşık 1 dakika sürer bir işlem) tarafından düşürülmüştür bir kez infiltrasyon odası hızlı bir şekilde geri atmosfer basıncı getirdi bunun üzerine sızma tamamlandıktan fırın giriş vana açarak 20-30 s.
Beş gün sonra infiltrasyon bitki materyali toplama ve sonraki çıkarma ve izole edilmesi istenen ürün (ler) için hazırdır. Bu noktadan sonra sadece bir doğal ürün çıkarma ve arıtma yaprak malzeme, herhangi bir doğal ürün kimyager aşina olan bir iş akışının işlemidir. İlk çıkarma ve sonraki arıtma için birçok farklı yöntem15adlı biri yok. En uygun seçimi yöntemleri ve kullanılan kesin şartlar bahçedeki ilgi yanı sıra beceri ve/veya ekipman kullanılabilirliğini belirli kimyasal özellikleri son derece bağlıdır. Bu protokol için hasat bitki yaprak malzeme körü körüne herhangi bir faiz triterpen ürün için takip edilebilir izole ürün için aşağı akım işlenmesi için bir tam genelleştirilebilir, adım adım yöntemi dahil etmek mümkün değildir, ne de çok olur Bunu yapmak denemek uygun. Ancak, bu iletişim kuralı, bizim laboratuvar ve deneyimlerimize en oksijenli aglycone triterpen ürünler için genelleştirilebilir kanıtladık işleminin, erken aşamaları için bazı yöntemler kullanılan temel iş akışı genel bakış sağlar. Bu iki nispeten nadir teknikleri, yani, basınçlı Solvent Ekstraksiyon (PSE) ve güçlü temel iyon değiştirme reçine kullanarak klorofil kaldırma için uygun hànzú faz yöntemi içerir.
PSE katı matrisleri küçük organik moleküllerin çıkarılması için son derece etkili bir tekniktir. Çekimi (ca. 100-200 bar) basınç altında gerçekleştirilir, kaynama aşan hafifletilmiş sıcaklıklar kullanabilme olmanın en büyük avantajı ayıklama solvent gelin. Bu önemli ölçüde zaman ve solvent ayrıntılı bir emme, basit refluxing veya Soxhlet çekimi16gibi diğer sıcak solvent teknikleri karşılaştırıldığında elde etmek için gerekli miktarı azaltabilir. Ticari tezgah üstü PSE aletleri are elde edilebilir, hangi değiştirilebilir ayıklama hücre ve taşıma, Isıtma ve izleme otomatik çözücü kullanmak. Bu bu teknik son derece elverişli hale getirir. Belki daha az tehlikeli, özellikle sınırlı pratik Kimya deneyime sahip operatörler için de.
Sabunlaşma ham yaprak özler reflü sıvı/sıvı bölümleme tarafından takip altında chlorophylls sonraki arıtma veya analiz önce toplu kaldırılması için ortak bir tekniktir. Ancak, bu kez operasyonel daha büyük ölçeklerde rağbet görebilir. Ayrıca, algılama arabirimi veya ürün kaybı emülsiyonlar oluşumu nedeniyle sorunlu olabilir. Hànzú faz hidroliz gerçekleştirmek için güçlü temel iyon değiştirme reçineler kullanımı uygun bir alternatif hizmet verebilir. Hydrolyzed klorofil pigmentli bölümünü reçine için yapıştırılan kalır ve sadece filtrasyon tarafından kaldırılabilir. Bu iletişim kuralı bir piyasada bulunan temel iyon değiştirme reçine istihdam daha önce raporlanmış analitik prosedür17 partiye hazırlık ölçek uyarlaması kullanır.
Aşağıda bu bitki tabanlı platformu kullanan triterpeneler partiye hazırlık ölçekli üretim için detaylı ve hızlı iletişim kuralı tanımlar. Bu iletişim kuralı onlarca yüzlerce izole triterpen ürün miligram uygulamalar için yapısal bir karakterizasyonu nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi tarafından hazırlamak ve/veya daha fazla fonksiyonel olarak çalışması için düzenli olarak bizim laboratuvar olarak kullanılır deneyleri.

<table><tbody><tr><td>GC-MS instrument</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler suitable for performing PCR reactions</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/&gt; 15000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Standing incubator</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge bottles (1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum infiltration apparatus</td><td>bespoke</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>9 x 9 cm plant pots</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Freeze drying apparatus (=/&gt; 8 litre condenser capacity)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Spatulas (assorted sizes)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance (5 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balance (2 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 freezer</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>Safety glasses</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lab coat</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tips (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Transfer pipettes (size 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (Size: 100 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&amp;reg; SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable purple nitrile gloves</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Top filter for E-914, cellulose</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (diatomaceous earth)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1.09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;5&amp;rsquo;-dimethoxy-4&amp;rsquo;-acetophenone (acetosyringone)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>MP biomedicals</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE gel</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB broth Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&amp;reg;&amp;nbsp;900 hydroxide (basic ion exchange resin)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher</td><td>H/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td><td>Supplier New England Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 vector</td><td>Lomonossoff laboratory John Innes Center</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana seeds</td><td>any reputable supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

transient expression in nicotiana benthamiana leaves for triterpene production at a preparative scale

Triterpeneler en büyük ve bitki doğal ürünlerin çoğu yapısal olarak farklı aileler vardır. Birçok triterpen türevleri medicinally ilgili biyolojik aktivitesi sahip gösterilmiştir. Ancak, şu ana kadar bu potansiyeli triterpen türevi ilaçlar klinikte bir bolluk içine çevrilmiş olmayışıdır. Belki bu (en azından kısmen) sınırlı pratik sentetik erişim için bu sınıfa bileşik bir sonucu yapısı-etkinlik ilişkiler keşif ve gelişimi bastırmak bir sorun kurşun, adaylar tarafından geleneksel tıbbi Kimya iş akışları. Onların büyük çeşitlilik rağmen triterpeneler tüm tek bir doğrusal habercisi türetilmiştir 2,3-oxidosqualene. İ. benthamiana biyosentetik enzimlerin geçici Contegra ifade 2,3-oxidosqualene, doğal olarak bu ana makine tarafından üretilen değil yeni yüksek değerli triterpen ürünlerin üretimi doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Agro-infiltrasyon geçici i. benthamianaifadede ulaşmada etkin ve basit bir yoludur. İşlem bitki yaprakları infiltrasyonu Agrobacterium tumefaciens ilgi ifade construct(s) taşıyan bir süspansiyon ile içerir. Ortak bir ek A. tumefaciens infiltrasyonu zorlanma habercisi kaynağı önemli ölçüde artırır bir enzim artar bir ifade yapısı kodlama verimleri taşıyan. Beş günlük bir süre sonra infiltre yaprak malzeme hasat ve elde etmek ve elde edilen triterpen ürün (ler) izole işlenebilir. Bu yalnızca denemede kullanılan bitkiler sayısını artırarak ölçeklenebilir, güvenilir ve sürekli bir süreçtir. Burada olan bu bitki tabanlı platformu kullanan triterpeneler hızlı hazırlık-ölçekli üretim için bir protokol açıklanan. Protokol dört bitkiler, bitkiler yüzlerce batch-wise infiltrasyon kısa bir süre içinde etkinleştirme aynı anda infiltrasyonu sağlar bir kolayca yinelenebilir vakum infiltrasyon aparat kullanır.

Tipik izole verimleri enzim/enzim kasanın soruşturma, hedef bahçedeki kimyasal kararlılık ve arıtma süreci zorlu nasıldı altında bağlı. Biz daha önce β-amyrin izole verimi bildirdin 0,12 3.87 mg-gram arasında değişen bizim Kombinatorik biyosentezi deneyler gelen türevleri i. benthamiana yaprak tozu kuru. Bu bileşiklerin yaygın oksidasyon düzeyi arasında değişiyordu ve doğal olmayan enzimler (Şekil 3)8kombinasyonları dahil. Bu iletişim kuralı düzenli olarak bizim laboratuvarda onlarca veya yüzlerce miligram yapısal karakterizasyon için saflaştırılmış ürün üretmek için NMR spektroskopisi ve aşağı akım fonksiyonel deneyleri tarafından kullanılır. Biz de bu platform partiye hazırlık programı triterpen iskele β-amyrin % 98'den büyük bir saflık, 0.8 g üreterek göstermiştir. Bu deney 459 bitkiler kullanılan ve 3.3 mg kuru gram başına izole bir verim temsil eden i. benthamiana yaprak tozu8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> Şekil 1: Şematik Özeti. 2,3-oxidosqualene partiye hazırlık ürünler imalatı, yeni yüksek değerli triterpen doğru endojen malzemeleri aktarmak için i. benthamiana varak biyosentetik enzimlerin geçici ifade istismar işlem şematik gösterimi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> Şekil 2: Vakum yaklaşıyor İnşaat ve işlem bir) Fabrika sahibi bir kanat müstakil ısmarlama. b) Bespoke tesisi sahibi kanatları bağlı. c) inversiyon ve bitkilerin batma. d) infiltrasyon Bath ekleme. e) infiltrasyon banyoda infiltrasyon odası içinde yer. f) komple vakum yaklaşıyor: (1) vakum pompası (2) bağlantısından vakum pompası vakum rezervuar (3) vakum rezervuar yalıtım Vana vakum rezervuar ve infiltrasyon odası (5) basınç göstergesi (6) hava emme valfi (7) arasında bağlantı (4) İnfiltrasyon odası (8) vakum rezervuar. g) temsilcisi bir bitki yeşil flüoresan protein (GFP) için bir ifade yapısı ile infiltre beş gün sonrası infiltrasyon büyüme sonra bırakır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> Şekil 3: daha önce bu iletişim kuralı8kullanarak β-amyrin türevlerinin partiye hazırlık üretim için temsilcisi sonuçları rapor. Bu tablo tarafından izole verimleri emredilmiştir. Sütunları koşullu olarak göreli değeri renk göstergesi ile biçimlendirilir. Kırmızı Yüksek, yeşil = düşük (yine de ara sarı) =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale at JoVE.com

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır

Geçici Contegra ifade Nicotiana benthamiana yaprakları biyosentetik enzimlerin 2,3-oxidosqualene yeni yüksek değerli triterpen ürünleri doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Burada olduğunu hızlı (5 gün) hazırlık-ölçekli üretim triterpeneler ve bu güçlü bitki tabanlı platformu kullanan analogları için detaylı bir protokol açıklanan.

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

transient-expression-nicotiana-benthamiana-leaves-for-triterpene

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

17.2K Görüntüleme.  John Innes Centre. Geçici Contegra ifade Nicotiana benthamiana yaprakları biyosentetik enzimlerin 2,3-oxidosqualene yeni yüksek değerli triterpen ürünleri doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Burada olduğunu hızlı (5 gün) hazırlık-ölçekli üretim triterpeneler ve bu güçlü bitki tabanlı platformu kullanan analogları için detaylı bir protokol açıklanan.

Video: Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Gibson Meclisi ve Gen Tabancası kullanarak Tütün geçici Gen İfadesi

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Çevre

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

Rekombinant Cellulase Cel5A İfade itibaren<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Tütün Bitkilerinde

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Biyokimya

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Diterpenoid Doğal Ürünlerin Enzimatik Üretimi ve Saflaştırılması için Özelleştirilebilir Bir Yaklaşım

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Biyoloji

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Bakteriler, Böcek Hücreleri ve Bitki Sistemleri: Rekombinant Protein Farklı Biofactories İfade Karşılaştırmalı Analizi

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

Nicotiana benthamiana'da Geçici Olarak Ifade Edilen IgG Füzyon Proteinlerinin Üretimi

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

N. benthamiana Yapraklarından GFP-His'in Verimli Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from plants is one of the most critical steps in the production process. Typically, proteins were purified from total soluble proteins (TSP), and the presence of miscellaneous intracellular proteins and cytochromes poses challenges for subsequent protein purification steps. Moreover, most therapeutic proteins like antigens and antibodies are secreted to obtain proper glycosylation, and the presence of incompletely modified proteins leads to inconsistent antigen or antibody structures. This work introduces a more effective method to obtain highly purified recombinant proteins from the plant apoplastic space. The recombinant Green fluorescent protein (GFP) is engineered to be secreted into the apoplast of Nicotiana benthamiana and is then extracted using an infiltration-centrifugation method. The GFP-His from the extracted apoplast is then purified by nickel affinity chromatography. In contrast to the traditional methods from TSP, purification from the apoplast produces highly purified recombinant proteins. This represents an important technological improvement for plant production systems.

Yazar Spotlight: Bitki Hücrelerinden Rekombinant Proteinlerin Verimli Bir Şekilde Geri Kazanılması için Apoplast Protein Ekstraksiyonunun Optimize Edilmesi

The purification of recombinant proteins from plant systems is usually challenged by plant proteins. This work provides a method to effectively extract and purify a secreted recombinant protein from the apoplast of Nicotiana benthamiana.

Bitki Tarafından Üretilen Rekombinant Proteinin Saflığını Artırmak için Apoplast-Ekstraksiyon Bazlı Yöntem  

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from ...

Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST