Bu yöntem Klebsiella alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, hangi genler kapsül ve ilişkili öldürücüler düzenlemek için kullanılır gibi. Bu tekniğin başlıca avantajları, kapsüllü ve kapsülsüz suşları fiziksel olarak ayırmak için bir araç sağlar ve aynı zamanda kapsül üretim suşları arasında hızlı karşılaştırmalar için kullanılabilir. Bu yöntem Klebsiella kapsül regülasyon çalışması için geliştirilmiş olmasına rağmen, aynı zamanda farklı bakteri türlerine uygulanabilir.
Bu yönteme yeni olan bireyler, degradeleri dökmek ve hücreleri degradelere eklemek oldukça zor olabileceğinden mücadele edeceklerdir. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü ustalaşması zor olan teknikleri gösteririz, kullanıcıya yardımcı olmak için öneriler ve ipuçları sağlarız. Başlamak için, steril bir döngü ile bir stok plaka tek bir koloni seçin ve uygun bir et suyu 10 mililitre aşılamak.
Bir gecede kültürü kuluçkaya yatırın. Sonra 15 mililitrelik tüp ve santrifüj için kültür aktarın. Daha sonra, supernatant atın ve PBS iki mililitre pelet yeniden askıya.
Santrifüj'u tekrarlayın ve ortaya çıkan supernatant'ı atın. Sonra pbs iki mililitre pelet yeniden askıya. Yoğunluk gradyan seyreltmelerini oluşturmak için yoğunluk gradyan ortamını PBS ile birleştirin.
Sonra her bir degrade seyreltme 600 mikrolitre tek tek iki mililitre tüpler içine aliquot. 200 mikrolitrelik pipetli 100 mikrolitre hücre alın ve pipet ucunu tüpün yan tarafına birçok degradeden birinin menisküsünün hemen altına yerleştirin. Bakteri hücrelerini çok yavaş bir şekilde degradeye aspire edin, arayüzü karıştırmamaya özen gösterilsin.
8, 000 g's 10 dakika için hazırlanan tüpler santrifüj. Bundan sonra, degrade tabakasının hemen üzerinde hücreleri korumak için gerekli minimum degrade seyreltme görselleştirmek için bir raftüpleri aktarın. İlk olarak, beş mililitrelik yuvarlak alt tüp içine en seyreltik yoğunluk gradyan seyreltme bir mililitre aktarın.
1.5 inç iğne ile bir şırınga kullanarak, sonraki en konsantre yoğunluk gradyan bir mililitre almak. İğneyi tüpün altına yerleştirin ve şırınganın içeriğini çok yavaş enjekte edin. Yoğunluk degradesinin her adımında net bir arayüz olmalıdır.
Eğer katmanlar karışırsa, bakterilerinizin temiz bir şekilde ayrılmasını sağlayamaz. Degrade seyreltmeleri arasındaki arabirimi rahatsız etmemek için iğneyi degradeden hafifçe çıkarın. Sonra bir rafa tüp yerleştirin.
Dikkatle tüp gradyan üstüne hazırlanan hücrelerin 600 mikrolitre ekleyin. Sonra bir tüp adaptörü tüp yerleştirin ve denge sağlamak için adaptör ile tüp tartmak. Bundan sonra, bir tezgah üstü santrifüj içinde sabit bir açı rotor tüp adaptörü yerleştirin ve 30 dakika boyunca tüp santrifüj 3, 000 g's.
Son olarak, santrifüjden sonra tüpü dikkatlice çıkarın, rafa yerleştirin ve sonuçları fotoğraflayın. Bu protokolde, yoğunluk gradyan santrifüj ürettikleri kapsüle göre bakteri suşlarını ayırmak için kullanılmıştır. Kesin sonuçlar bakteri türlerine bağlı olsa da, çoğu suş degrade içinde tek bir konuma göç edecektir.
Bir bakteriyel mutant kütüphane için bu yöntemin uygulanması degrade üzerinde büyük bir bant, degrade üst tabakası ile daha az yoğun bir bant ve alt kısmında küçük bir acapsular fraksiyonu üretmelidir. Bu yordamı çalışırken, degrade arabirimleri karışık olmamalı ve degrade hava kabarcıkları içermemelidir hatırlamak önemlidir. İşlemden sonra kapsül miktarlarını incelemek için üronik asit tonu veya mikroskopi gibi doğrulama yöntemleri yapılmalıdır.
Bu özellikle yeni suşlar için bu tekniği kullanırken önemlidir. Hazard Group 2 patojenleriyle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Düzeltici koruyucu ekipman, risk değerlendirmelerine bağlı kalma ve kültürlerin doğru bir şekilde atılması gibi önlemler bu işlemi gerçekleştirirken her zaman alınmalıdır.
