Yani bu yöntem makrofaj biyoloji salanındaki temel soruların cevaplandırılmaya yardımcı olabilir, örneğin protein düzeyinde çeşitli ortamlar altında aktivasyon durumunun nasıl karakterize edilebildiği gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, etiketsiz niceleme yöntemi kullanılarak insan makrofajlarında birçok proteinin farklı bir ifade elde edilmesi ne kadar fırsat sağlamaktadır. Prosedürü gösteren benim laboratuvarımdan Marie Malier ve Magali Court olacak.
Başlamak için, çözeltiLRSC almadan önce oda sıcaklığına ısınabilir, böylece iki 50 mililitresantrik santrifüj tüpleri her içine yoğunluk gradyan hücre ayırma çözeltisi 15 mililitre ekleyin. Yoğunluk sıcaklığa bağlı olduğundan bu esastır. LRSC'yi 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne boşaltın.
50 mililitreye kadar 1x PBS ekleyin ve karıştırın. Sonra, çok yavaş, dengelenmiş yoğunluk gradyan çözeltisi 15 mililitre üstüne karışımı 25 mililitre ekleyin. Bu adımsırasında aşamaları karıştırmamaya dikkat edin.
Kan bu aşamada herhangi bir rahatsızlık olmadan yoğunluk gradyan çözeltisi üzerine eklenmelidir. Her iki santrifüj tüpünü de 700 G'de 25 dakika boyunca santrifüjsüz olarak ayırın. Yoğunluk gradyan santrifüjünün sonunda, alttan yukarıya doğru katmanlar, pelet, yoğunluk gradyan çözelti fazı, PBMC tabakası ve seyreltilmiş plazmayı oluşturan eritrositler ve granülositlerdir.
Bir pipetle, plazma fazını aspire etmeden geçirin. Sonra, yeni bir 50 mililitre santrifüj tüpü içine PBMC tabakası toplamak. 300 G.Aspirate supernatant ve makrofaj orta 40 mililitre pelet yeniden askıya 10 dakika boyunca bir yıkama kurulum ve santrifüj olarak PBMCs için 1x PBS 50 mililitre kadar ekleyin.
Bir Malassez odasında PBMCs kanepede sonra, bir santrifüj tüpü için deneme yapmak için gerekli PBMCs miktarını aktarın. Hücreleri 300 G.Aspirate'da 10 dakika santrifüj edin ve 10 milyon PBMC'de sıralama tamponunun 80 mikrolitresinde peleti yeniden askıya alın. Daha sonra, 10 milyon PBMC'ye 20 mikrolitre CD14 mikroboncuk ekleyin.
İyi bir şekilde karıştırın ve sürekli ajitasyon altında 4 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, bir yıkama adımı olarak 10 milyon PBMC'ye bir mililitre sıralama tamponu ekleyin ve daha önce olduğu gibi santrifüj edin. Daha sonra, supernatant aspire ve 100 milyon PBMCs başına sıralama tampon 500 mikrolitre pelet yeniden askıya.
Şimdi, ayırıcının manyetik alanına bir sütun yerleştirin. Üç mililitre sıralama arabelleğiyle durulayarak sütunu hazırlayın. Hücre süspansiyonu sütunüzerine uygulayın.
Daha sonra gerekirse, sonraki boyama için etiketlenmemiş hücreleri içeren yoluyla akışı toplamak. Sütunu üç mililitre sıralama arabelleğiyle üç kez yıkayın. Sütununuzu kurutmamaya dikkat edin.
Ardından, sütunun altına bir toplama tüpü yerleştirin ve ayırıcıdan çıkarın. Yıkamadan sonra, pipet sütuna tampon sıralama beş mililitre. Hemen sıkıca sütuniçine piston iterek manyetik etiketli hücreleri dışarı floş.
Son olarak, monositleri kaplamadan ve metin protokolünde açıklandığı gibi makrofaj polarizasyongerçekleştirmeden önce bu adımları yeni bir sütunla tekrarlayın. Hipoksik durum analizi yapmak için monositleri ve makrofajları oksijen kontrollü bir ortamda koruyun. Deney sırasında istenilen oksijen kısmi basınç altında hücreleri korumak için bir hipoksi çalışma istasyonu kullanın.
Düşük oksijen basıncı altında çalışırken, tüm ortam ve yıkama tamponları istasyonu altında hazırlamak ve sıvı doğru kısmi basınç elde etmek için yeterli beklemek önemlidir. Uyarlanmış bir başlık altında bir tampon hücre lisis gerçekleştirin. Her örnek için 300, 000 hücrenin protein eşdeğerini 4-12%bis-tris akrilamid jellerine yükleyin.
Elektroforetik göçün süresini kontrol ederek her protein örneğinin burada gösterildiği gibi altı jel bandına bölünmesini sağlayın. Sabitleme ve metin protokolünde açıklandığı gibi boyama sonra, temiz bir neşter ile protein bantları çıkarmak. 500 mikrolitrelik tüpler içine yerleştirmeden önce her excised bant zar.
Şimdi, jel dilimlerini 200 mikrolitrede 25 milimolar amonyum bikarbonatta 37 derecede 20 dakika yıkayın ve her adım arasında amonyum bikarbonat atın. 25 milimolar amonyum bikarbonat ve asetonitril bir yıkama ile bu izleyin. Daha sonra jel parçalarını %100 asetonitile 200 mikrolitre ile 10 dakika dehydrate.
56 santigrat derece 45 dakika boyunca 10 milimolar DTT ve 25 milimolar amonyum bikarbonat ile her jel parçası kuluçka. Daha sonra, DTT atın ve oda sıcaklığında karanlıkta 35 dakika boyunca 25 milimolar amonyum bikarbonat 55 milimolar iodoacetamide ile jel parçası inkübün. Alkiliyasyonu durdurmak için, kullanılan çözeltiyi atın ve her jel parçasını oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 25 milimolar amonyum bikarbonatta 10 milimolar DTT'lik 200 mikrolitre ile kuluçkaya yatırın.
Jel parçalarını 25 milimolar amonyum bikarbonat 200 mikrolitre yıkayın. Daha sonra, 10 dakika boyunca% 100 asetonitil 200 mikrolitre ile dehydrate. Üreticinin talimatlarına göre Tripsin/Lys-C Karışımı ile proteinleri bir gecede 37 santigrat derecede sindirin.
Düşük emilim tüpleri 15 dakika boyunca% 50 asetonitil 50 mikrolitre ekleyerek jel parçalarından elde edilen peptidler ayıklayın. 15 dakika boyunca %5 formik asit 50 mikrolitre ekledikten sonra, 15 dakika boyunca% 100 asetonitril 50 mikrolitre ekleyin. Peptidlerin emilimini ve numune kaybını sınırlamak için düşük emilim tüplerinde her bir fraksiyonu çekin ve kurulayın.
Örnekleri metin protokolünde ayrıntılı olarak daha fazla analiz edinceye kadar 80 santigrat derecede saklayın. Burada gösterilen cd14 pozitif monositlerin manyetik boncuk seçimi nden sonra akış sitometrisi tarafından değerlendirilen temsili saflıktır. Farklılaştırılmış insan makrofajlarının faz kontrast görüntülemesi, dokuz günlük kültürden sonra elde edilen iki farklı kutuplaşma için elde edilen morfolojilerin heterojenliğini göstermektedir.
Gümüş lekeli SDS sayfa jelleri kullanılarak off-jel sindirim bir örnek gösterilir. Hücre lysis ve çözelti içi sindirim sonrası proteinin değerlendirilmesi, lysis sırasında bozulma nın olmadığını ve sindirimin verimliliğini gösterir. Burada gösterilen pozitif iki bir elektrik yükü ile MS spektrumu üzerinde 597,29 kütle-şarj oranı bulunan bir peptid bir çarpışma kaynaklı dissosilasyon spektrumu bir örnektir.
Bu spektrumdan, ilgili sıra belirlendi. Analizden sonraki nihai sonuç, farklı ifade edilmiş proteinler kullanılarak tüm polarizasyon durumlarının hiyerarşik kümelenmelerini temsil eden bir ısı haritasıdır. Analiz, %3 oksijen durumundaki tüm polarizasyonlarda aşırı ifade edilen bir protein kümesini ortaya koymaktadır.
Bu yordamı denerken, protokolünüzü buna göre uyarlamak için yeni örneklerde ne tür bir kesirleme gerçekleştireceğinize öncelikle karar vermeniz gerektiğini unutmamanız önemlidir. Bu çalışmayı kullanan proteomik yaklaşım, makrofaj biyolojipolarizasyon çalışmaları alanında son yıllarda kullanılan genomik yaklaşımların tamamlayıcısidir. Gelişiminden sonra, bu teknik immünoloji alanında araştırmacı insanlarda ve diğer memelilerde bağışıklık hücrelerinin aktivasyon çeşitli durumları keşfetmek için önünü açar.
DTT ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın, bu nedenle bu işlemi yapmak için uyarlanmış bir başlık altında çalışmanız gerekir.
