Canlı farelerde kolon mini-endoskopik değerlendirilmesi allojenik, hematopoetik kök hücre nakli üzerine akut graf-versus-host hastalığı, GvHD, bağırsak belirtileri araştırmak için önemli deneysel destek sağlar. Akut GvHD'ye bağlı kolitin invaziv olmayan değerlendirmesi altın standart histopatolojinin yerine geçerek doku örneklerini gereksiz hale getirmek için tekrarlanan hayvan kurbanlarını tamamlayabilir. Prosedürü gösteren Vera Buchele, benim laboratuvarımdan bir post-doc olacaktır.
Alıcı BALB/c farelerinin toplam vücut ışınlamabir gün sonra, temiz bir çalışma kılıfı üzerinde eğilimli pozisyonda bir CD-45.1 canlı 5B6 SJL donör fare yerleştirin ve bir chilles topuk kürk kaldırmak için bir 13 cm kavisli ve tırtıklı ucu bir simkin forseps kullanın. Sertleştirilmiş 8,5 cm ince makas kullanarak düz uçları ile, ön bacaklar dan deri ve kürk kaldırılmasını kolaylaştırmak için kesi cranially uzatarak, forceps ve bir topuk arasında deri eğim. Deri arka ekstremitelerden çıkarıldığında, her kalça, ayak bileği ve diz eklemi ile kesilir.
Her arka ekstremitenin uyluk ve sapını, buz üzerinde PVS ile dolu tek bir 92 mm Petri kabında saklayın ve her kemikten mümkün olduğunca fazla kas çıkarın ve her temizlenmiş uyluk ve tibia'yı ıslak buz üzerinde steril RPMI 1640 orta 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Kemik iliğini izole etmek için, bir seferde bir kemiği taze RPMI 1640 ortamıyla dolu yeni bir 92 mL Petri kabına aktarın ve her kemiğin uçlarını kesmek için neşter kullanın. Daha sonra, kemikleri bir seferde 1 mL taze ortamla 5 mL orta içeren 50 mL'lik toplama tüpüne yıkamak için 26 kalibrelik iğne ile donatılmış 1 mL şırınga kullanın.
Tüm kemikler temizlendiğinde, hücreleri 40 mikrometrelik örgü ekran hücresüzden yeni bir 50 mL toplama tüpüne filtrelemeden önce tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için ufalanmış kemik iliği parçalarını yavaşça yukarı ve aşağı inceleyin. Hücreleri santrifüj ile peletve oda sıcaklığında üç dakikalık kuluçka için amonyum klorür potasyum lisis tampon 5 mL hücreleri yeniden askıya. Kuluçka sonunda, 10 mL PVS ile reaksiyonu durdurun ve hücreleri tekrar santrifüj edin.
Yeniden sayma için taze PVS 2 mL pelet askıya ve aşağı akış akışı sitometrik analiz için altıncı hücre aliquot altı kez 10 kenara koyun. Daha sonra, cd90.2-pozitif T hücrelerini üreticinin talimatlarına göre, kemik iliği tek hücreli süspansiyondan manyetik olarak tüketmek için ticari olarak kullanılabilen bir hücre saflaştırma kiti kullanın ve ayrılmadan önce ve ayrılmadan sonra hücre saflığı ve bileşiminin aşağı akış akışı sitometrik analizi için T-hücre tükenen t-hücre-tükenmiş eluat bir kez 10 kenara koyun. Daha sonra, her Bir ışınlanmış alıcı hayvanın venöz sinüs retrobulbar uzaya intravenöz PVS 100 mikrolitre beş kez 10 enjekte etmek için 30-gauge iğne ile donatılmış bir 1-mL şırınga kullanın.
Ertesi gün, bir donör hayvandan hasat edilen bir dalak 50 mL toplama tüpünde 40 mikrometrelik bir örgü süzgeciüzerine yerleştirin ve dalak dokusunu tüpe süzgeçten geçirmek için şırınga pistonlu kullanın. Tüm splenositleri toplamak için süzgeci ve pistonu PVS ile yıkayın ve hücreleri santrifüj ile pelet. Kırmızı kan hücresi lisisi kanıtlandıktan sonra, beyaz kan hücrelerini saymak için yeniden askıya alın ve aşağı akış sitometrik analizi için altıncı hücre aliquot'una altı kez 10'luk bir kenara koyun.
Toplam splenositlerden toplam CD3-pozitif T-hücre izolasyonu için, üreticinin talimatlarına göre ticari olarak kullanılabilen bir hücre saflaştırma kiti kullanın ve ayrılmadan önce ve sonra hücre saflığının ve bileşiminin aşağı akış akışı sitometrik analizi için pozitif hücre fraksiyonundan bir kez 10'dan altıncı CD3-pozitif T-hücre aliquot'una bir kenara koyun. Daha sonra, GvHD'yi indüklemek için her alıcı farenin retrobulbar uzayına 100 mikrolitre PVS intravenöz olarak beşinci alloreaktif CD3-pozitif T hücrelerine yedi kez 10 enjekte edin. Distal kolorektal bölgenin mini endoskopisi ile GvHD ile ilişkili lezyonları puanlamak için, bir elinizle kuyruk kökünün hemen üzerinde alıcı bir hayvanın kuyruğunu kaldırın ve diğer elinizi kullanarak anüs yoluyla rektuma endoskopu dikkatlice takın.
Hava akımı kolorektal lümeni şişirirken, endoskobu aboral yönde yavaşça ve dikkatlice ileri doğru hareket ettirin. Kolon bağırsak yaralanmaları önlemek için, bu konumlandırma yardımcı olmak için canlı video ekranı kullanarak lümen orta alanda endoskop tutun. Video akışını kaydetmeye ve iltihabı puanlamaya başlayın, gösterildiği gibi parametreleri puanlayarak kolon GvHD ile ilgili iltihabı değerlendirin.
Bir puanlama noktası bulunduğunda, farklı parametreleri değerlendirmek için endoskopu hafifçe ve hafifçe ileri ve geri hareket ettirin. Parametre translucency ve dışkı tutarlılığını değerlendirmek için, kolon duvarı ile ilgili olarak daha geniş bir mesafede endoskop yerleştirin. Lezyonun tanecikliliğini ve vaskülaritesini değerlendirmek için, endoskopu kolon duvarına yakın bir yerde yerleştirin ve endoskopucu ucuyla kolon duvarına dikkatlice doslanmış gerilim uygulayın.
Puanlama işlemi tamamlandıktan sonra, kaydı durdurun. Kontrollerle karşılaştırıldığında, allojenik hematopoeik kök hücre nakli, sistemik GvHD fenotipinin tekrarlanabilir derecede sağlam indüksiyonuna neden olur ken, alıcı hayvanlarda klinik GvHD skorları giderek artmaktadır. Bu mini-endoskopik olarak değerlendirilebilen kriterler özellikle allo-response-driven kolit skorlama parametreleri bağlamında daha önce bildirilen syngeneic kolit ten uyarlanmıştır kesin açıklama, puanlama, ve distal kolonda intestinal GvHD hastalığı ile ilişkili lezyonların derecelendirilmesi.
Gerçekten de, mini-endoskopik tabanlı derecelendirme sistemi aslında GvHD yoksun kontrol farelerden bağırsak iltihabı ciddi belirtileri ile donör-lenfosit alan farelerin kolay bir ayrımcılık sağlar. Mini-endoskopik tabanlı derecelendirme sistemi histopatolojik çalışmalar geçersiz kılınması ciddi GvHD ile ilgili inflamasyon etkilenen farelerin kolon benzer güçlü histopatolojik belirtileri görüntülemek doğruladı. Buna karşılık, kontrol farelerin kolon dokuları hiçbir görüntülenen, en fazla, inflamasyon hafif histopatolojik işaretler, kolit mini-endoskopik olarak tespit edilebilir işaretlerin sanal yokluğu ile uyum içinde.
Ayrıca, mini-endoskopik ve histopatolojik olarak değerlendirilmiş kolit aktivitesi ile sistemik GvHD skorları arasındaki korelasyon çalışmaları, histopatolojik derecelendirmeden elde edilen orta-yüksek dereceli bağırsak GvHD ilişkili kolon inflamasyon skorlarının eksikliğini güvenilir bir şekilde tahmin eden mini endoskopik olarak üçten daha az veya üç etek puanın belirlendiğini göstermektedir. Buna ek olarak, endoskopik olarak değerlendirilen intestinal GvHD şiddeti sistemik GvHD hastalığı aktivitesi ile korelasyon gösterir. Kolon iltihabının mini-endoskopik değerlendirmesinin sonuçlarını standartlaştırmak ve zaman içinde farklı fareler ve deneyler arasında karşılaştırılabilirliği sağlamak için puanlama için tanımlanmış bir anatomik alan seçilmelidir.
Kolon iltihabı puanlama ek olarak, mini-endoskopik kurulum içinde yerleşik çalışma kanalı standart histopatoloji gibi çeşitli downstream analizleri için geçerli görüş güdümlü doku biyopsileri alınmasına olanak sağlar. Mini endoskopinin non-invaziv doğası nedeniyle, akut GvHD ilişkili kolit tekrar tekrar hemen her zaman aynı hayvan içinde değerlendirilebilir, bu nedenle bağırsak GvHD içine büyüleyici anlayışlar vererek.
