Kordon kanı mononükleer hücreler, ya da CBMC, rejeneratif tıp için potansiyel bir hücre kaynağı olarak ortaya çıkmıştır, insan lökosit antijen yazma hücre bankacılığı sistemi için gerekli olduğu için. CBMC'ye bağlı pluripotent kök hücreler veya CMBC-iPSC'ler keratinositler ve fibroblastlar olarak ayırt edilebilir. 3Boyutlu deri organoidi üretmek için dermatolojik araştırmalar yapıyoruz.
CBMC-iPSC'yi vitronektin kaplamalı 100 mililitrelik plakalara 37 santigrat derece ve %10 karbondioksit le başlayın. Hücreler %80 birleştiğinde, kültürleri PBS ile yıkayın ve plaka başına bir mililitre bir mililitre lik bir mililitre 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle iki dakika tedavi edin. Hücreler ayrıldığında, plaka başına üç mililitre E8 orta ile reaksiyonu durdurun ve santrifüj ile hücreleri toplayın.
Geri sayım için beş mililitre E8 orta pelet yeniden askıya almak ve santrifüj için 15 mililitrelik konik tüp bir kez-10-to-altıncı hücreleri aktarın. 10 mikromolar rho-ilişkili kinaz veya ROCK inhibitörü ile desteklenen 2.5 mililitre embriyonik vücut oluşumu ortamı ile transfer hücreleri yeniden askıya. 125 mikrolitrelik hücre damlacıklarını kaplamasız bir kültür plakası kapağına aktarmak için bir pipet kullanın.
Tüm damlacıklar yerleştirildiğinde, damlacıkların 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitte 24 saat boyunca kapaktan asılması için tabağı ters çevirin. Ertesi gün, taze E8 orta ile kapağı yıkayın ve 50 mililitrelik konik tüp embriyonik vücut çözeltisi transfer. Embriyonik cisimlerin oda sıcaklığında bir dakika lığına yerleşmelerine izin verin, süpernatantı uyarmadan ve embriyonik bedenleri kültürlerine 37 santigrat derecede 90 milimetrelik Petri kabında ve farklılaşmalarına kadar %5 karbondioksitle yeniden askıya almadan önce.
CBMC-iPSC keratinosit farklılaşması için, embriyonik vücut kültüründen E8 ortamını taze E8 ortamı ile değiştirin, 37 santigrat derecede 24 saatlik kuluçka için kemik morfogenetik protein 4 mililitrebaşına bir nanogram ile takviye edin ve %5 karbondioksit. Ertesi gün, gösterildiği gibi 50 mililitrelik konik tüp içine embriyonik organları hasat ve organları oda sıcaklığında bir dakika yerleşmek için izin. Daha sonra, keratinosit diferansiyasyon orta altı mililitre ile supernatant değiştirin 1, veya KDM1, 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenen, ve tip IV Kollajen kaplı embriyonik organları transfer 100 milimetrelik çanak.
Kültürün sekiz gün sıfır, taze KDM1 ile her gün orta değiştirin, üç mikromolar retinoik asit ve mililitre başına 25 nanogram kemik morfogenetik protein her takviye 4 ve epidermal büyüme faktörü. 9 ile 12 arasında, kdm2 ile her gün orta değiştirin, üç mikromolar retinoik asit ile takviye, kemik morfogenetik protein mililitre başına 25 nanogram 4, ve epidermal büyüme faktörü mililitre başına 20 nanogram. Gün arasında 13 ile 30, KDM3 her gün orta değiştirmek, kemik morfogenetik protein mililitre başına 10 nanogram ile takviye 4, ve epidermal büyüme faktörü mililitre başına 20 nanogram.
CBMC-iPSC fibroblast farklılaşması için, 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenen fibroblast farklılaşma orta 1 altı mililitre embriyonik vücut kültürünü yeniden askıya, ve bir bodrum membran matris kaplı embriyonik vücut süspansiyon transfer 100 milimetrelik çanak. Kuluçka üç gün sonra, fibroblast farklılaşma orta 2 orta değiştirmeden önce, dört gün boyunca 0.5-nanomolar kemik morfogenetik protein 4 ile kültür tedavi. Kültürün yedinci gününde, bir hafta boyunca her gün fdm2 için orta değiştirin.
Kültürün 14. Yeniden sayma için fibroblast farklılaşma orta 1 beş mililitre hücreleri askıya almak ve olmayan bir kaplama çanak için iki kez-10-to-the-altıncı hücreleri aktarın. Kültürün 21. gününde, kültürden iki kez-10-altıncı hücreler ekibe tip I Kollajen kaplı 100 milimetrelik çanak taze fibroblast farklılaşma orta 1.
Kültürün 28. gününde, iPSC kaynaklı fibroblastların iki katı-10-altıya altısını kaplamalı olmayan yeni bir tabağa aktarın. Üç boyutlu deri organoid üretimi için, kültürden iPSC kaynaklı fibroblastlar hasat, ve santrifüj için 15 mililitrelik konik tüp için iki kez-10-to-the-beşinci hücreleri aktarın. Fibroblast peletini 1.5 mililitre fibroblast farklılaştırma orta 1 ve nötralize Tip I Kollajen çözeltisinin 1.5 mililitresi yeniden askıya alın.
Hücreleri altı kuyulu bir mikroplakaya, oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Çözelti katılaşmış olduğunda, kesici ucun üstüne iki mililitre orta litre ve kuyunun dibine üç mililitre ekleyin. Sonra gelasyon tamamlanana kadar, beş ila yedi gün boyunca kuvöz içine fibroblast matris yerleştirin, ve matris artık sözleşmeler.
Kuluçka sonunda, iPSC kaynaklı keratinositleri hasat edin ve santrifüj için 15 mililitrelik konik tüpe bir kere-10-altıncı hücreleri aktarın. Düşük kalsiyum epitel orta 50 ila 100 mikrolitre pelet yeniden askıya 1, ve keratinosit hücre çözeltisi ile fibroblast matris üzerinde orta değiştirin. 37 santigrat derecede 15 dakika sonra, eklenin üst kısmındaki ortayı iki mililitre epitel orta 1 ile değiştirin ve alt kuyudaki ortayı aynı üç mililitre ile değiştirin ve plakayı kuvöze geri verin.
İki gün sonra, ek insert ve normal kalsiyum epitel orta 2 ile kültür iki ek gün için orta değiştirin. Kültürün dördüncü gününde, tüm ortamı çıkarın ve sadece alt kuyuya üç mililitre mısırlaştırma ortamı ekleyin, hava-sıvı arayüzü oluşturmak için. Daha sonra aşağı analiz için 3D deri organoid hasat önce 14 gün kadar kuvöz için plaka iade edin.
CBMC-iPSC kaynaklı keratinositler primer keratinositlere benzer morfolojiye sahiptir ve bu hücrelerde keratinosit belirteçlerinin ekspresyonu artmaktadır. CBMC-iPSC kaynaklı fibroblastlar primer fibroblastlara benzer morfolojiye sahiptir ve pluripotent kök hücre belirteci Oct-4'ün ekspresyonu aşağı düzenlenirken, fibroblast belirteçleri yukarı düzenlenir. 3D deri organoidkalınlığı 3D kültür sırasında artar, 3D cilt organoid iPSC türetilmiş keratinositler ve fibroblastlar üretilir doğrulayan.
İki hafta sonra, nakledilen 3D deri organoid grefti, HNE analizi ile doğrulanan alıcı fare derisine etkin bir şekilde dahil edilir. Ayrıca, keratinosit olgunlaşma ve epidermal diferansiyasyon belirteçleri CBMC-iPSC türetilmiş 3D deri organoidleri ifade edilir, fonksiyonel bir farklılaşma gösteren, etkili greftleme, ve fare cilt kusurları etkili iyileşme. Biz yakın cilt taklit etmek için 3D cilt organoid katmanlı indükler yüksek kalsiyum ortamı ile geçmişte kullanın.
analiz, cildin tabakalaşmış olduğunu göstermektedir. CBMC-iPSC'ler deri greftleri için potansiyel bir hücre kaynağıdır ve CBMC-iPSC türetilmiş 3D deri organoidleri dermatoloji, kozmetik tarama ve rejeneratif tıp la ilgili çalışmalarda kullanılabilir.
