In vivo immünoresans lokalizasyonu veya IVIL için bu protokol, kanser araştırma, tespit ve tedavisi için tanı ve tedavi antikorlarının veya antikor bazlı ajanların in vivo biyodağılımını değerlendirir. Antijenlerin hücresel ekspresyonu ex vivo ortaya konan konvansiyonel immünoresan boyama aksine, IVIL yöntemi antikorların ve antikor bazlı ajanların canlı hayvanda nasıl dağıtıldığını açıklar. Bu video, IVIL yönteminin genel iş akışının anlaşılmasına yardımcı olacaktır.
Diğer uygulamalar ve antikorlar için protokolün başarılı bir şekilde çoğaltılması için önemli ayrıntılar gösterir. Devam etmeden önce palpasyon veya kaliper ölçümü ile uygun tümör büyümesi için istenilen kanser modelinden fareleri gözlemleyin. Üretici talimatları aşağıdaki koruyucu ve depolama tamponları kaldırmak için bir tuzsuzlama sütunüzerinde tavşan anti-fare B7-H3 ve tavşan IgG izotip kontrol antikorları arındırın.
Her antikor 33 mikrogram Aliquot dozajları bireysel mikrosantrifüj tüplerde eşleşin. Metin protokolünde açıklandığı gibi anesteziyi takiben, antikor solüsyonlarının kuyruk damar ısülasyonuna hazırlanın. Bir alkol mendili ile üç kez silerek hayvanın kuyruğunu dezenfekte.
Yaklaşık 30 saniye boyunca bir ısı yastığı ile ısıtarak kuyruk damarları dilate. Tüm hayvan ısıtma kaçının. 27-gauge kuyruk damar kateter kullanarak, iki lateral kuyruk damarları içine kelebek iğne takın.
İğnenin düzgün yerleştirildiğinden emin olmak için katetere kan geri akışını görselleştirin, böylece çözeltiler hayvana tam olarak girsin ve kuyrukta yakalanır. Sahneye yerleştirilen iğneyle kuyruğu dikkatlice onarmak için bir parça cerrahi bant kullanın. Kateteri 25 mikrolitre steril fosfat tamponlu salinile yıkayın.
Daha sonra, insülin şırıngaları kullanarak kateter içine antikor solüsyonu enjekte edin. Kateteri bir kez daha 25 mikrolitre steril PBS ile yıkayın. İğneyi kuyruktan çıkarın ve kanamayı durdurmak için basınç uygulayın.
Metin protokolünde açıklandığı gibi farenin insancıl ötenazisini gerçekleştirin ve fareyi supine konumuna getirin. Tümör dokularını çıkarmak için cerrahi makas ve forceps kullanın. Kuyruk en yakın meme bezleri kümesi arasında cildin sadece dış tabakası kavramak için forceps kullanın ve cerrahi makas bir çift ile küçük bir kesi yapmak.
Kesim içine kapalı makas tanıtın ve yavaş yavaş dikkatle altta yatan karın duvarı zarından cildi ayırmak için ucu açın, bozulmadan tutmak. Karın kadar dikey bir kesi yapmak, iç membran deri ayırmaya devam. Üçüncü ve dördüncü meme bezleri arasında, cildin geri çekilmesi ve meme bezlerinin görüntülenmesi sağlamak için karın boyunca yatay bir kesim yapmak.
Her tümör veya normal bezi forceps ile kavrayarak, dikkatle cerrahi makas kullanarak bağlı cilt kesip. Önceden etiketlenmiş ve optimum kesme sıcaklığı gömme ortamı ile doldurulmuş doku tek kullanımlık baz kalıpları içine excised dokular yerleştirin. Hızlı kuru buz üzerine yerleştirerek kalıpları dondurun.
Hedef dışı teslimatı incelemek için, diğer doku ları veya ilgili organları çıkarın. Bir kriyostat kullanarak, 10 mikron kalınlığında dondurulmuş doku blokları bölüm, ve önceden etiketlenmiş yapışma cam slaytlar üzerine bitişik bölümleri yerleştirin. Dondurularak dondurulmuş doku slaytlarını oda sıcaklığında PBS ile beş dakika boyunca durulayın.
Boyama sırasında ihtiyaç duyulan çözeltilerin hacmini azaltmak için doku kesitlerini hidrofobik bariyer kalemle ayırın. Doku bölümlerini %4 paraformaldehit solüsyonu ile beş dakika boyunca düzeltin. PBS'deki slaytları beş dakika erittikten sonra, PBS'de %0.5 Triton X-100 ile doku kesitlerini 15 dakika permeabilize edin.
Slaytları PBS'de beş dakika boyunca tekrar durulayın. Oda sıcaklığında bir saat boyunca hacim başına %3 büyükbaş serum albumin ve hacim başına %5 hacim içeren PBS içeren dokuları bloke edin. PBS'deki slaytları beş dakika boyunca duruladıktan sonra, ortak bir nükleer, vasküler veya sitoplazmik belirteç gibi kayıt tutan primer antikorlarla bölümleri kuluçkaya yatırın.
Burada, fare anti-fare CD31 engelleme çözeltisi bir-100 seyreltme kullanılır. Birincil antikor içeren slaytlar bir gecede dört santigrat derecede bırakılır ve slayt tepsisinde susuzluktan korunur. Kuluçkadan sonra, PBS'deki slaytları beş dakika üç kez durulayın.
PBS'yi her seferinde değiştirin. Birincil antikorları etiketlemek için slaytları ikincil antikorlarla kuluçkaya yatırın. Bu uygulama için, Alexa Fluor kullanarak anti-B7-H3 antikor görselleştirmek 546 konjuge keçi anti-tavşan antikor, ve engelleme çözeltisi Alexa Fluor 488 keçi anti-sıçan ikincil antikor ile CD31 görselleştirmek.
Oda sıcaklığında bir saat boyunca bir slayt tepsisindeki ışık ve susuzluktan kaydırakları koruyun. Daha önce olduğu gibi PBS slaytlar durulama sonra, doku diliminin ortasına montaj ortamının bir damla uygulayın. Dikkatlice hava kabarcıkları tuzak kaçınarak, bir coverslip yerleştirin.
Açık oje ile coverslip kenarları mühür ve kurumasını bekleyin. Metin protokolünde açıklandığı gibi konfokal mikroskopi görüntüleme ve nicel görüntü analizi ile devam edin. Temsili konfokal mikrograflar, normal veya karsinom dokuları içeren murine meme bezlerinde spesifik B7-H3 antikor-ICG konjuge ve nonspesifik izotip kontrol antikor-ICG konjuge lokalizasyonunun karşılaştırılmasını göstermektedir.
Iso-ICG veya B7-H3-ICG enjekte edilen ve CD31 ile karşılanmış bir hayvanın normal meme bezleri antikor konjugates hiçbir boyama göstermektedir. Normal dokuların standart ex vivo immünfloresans boyama ile B7-H3 ekspresyonu olmadığı gösterilmiştir. İnvaziv meme tümörlerinde, B7-H3-ICG güçlü vaskülatür bağlanır, in vivo temas ilk noktası, ve daha sonra heterojen tümör epitel leke için vaskülatür ekstravaza yapabiliyor.
İzo-ICG tümör dokuları içinde nonspesifik birikimi gösterir. Standart ex vivo immünfloresan boyama epitel ve endotel hücrelerinde B7-H3 belirteci düzgün ekspresyonu gösterir. Temsili konfokal mikrograflar, minnetkarsinom ve normal meme bezlerinde netrin-1 ekspresyonu veya izotip kontrol ekspresyonunu saptamak için in vivo immünfloresans lokalizasyon yöntemini göstermektedir.
In vivo immünoresans lokalizasyonu MMTV-PyMT tümörlerinde netrin-1 için epitel sinyali doğrular ancak normal meme bezlerinde doğrulanmaz. Ayrıca, kolokalize sarı sinyal ile gösterildiği gibi, meme tümörlerinde endotel hücrelerinde güçlü bir netrin-1 sinyali vardır. Sinyal normal meme bezlerinde önemli ölçüde zayıftır.
IVIL yöntemi nin başarılı bir uygulama için antikor dozu, doku toplama zamanlaması ve sekonder antikor seyreltme açısından optimize edilmesi gerekecektir. IVIL doku işleme gerektiren standart immünororesans boyama kullanılarak tespit edilemeyen konformasyonel epitopresiflerin hedefalınmasına izin verir. Ayrıca, terapötik antikorların hedef dışı teslimini değerlendirmek için tümör taşıyan farelerin sağlıklı organları toplanabilir.
Kanser araştırma ve yönetiminde antikor bazlı terapötik ve kontrast maddelerin artan kullanımı ile, IVIL yöntemi son derece farmasötik araştırma ve geliştirme için geçerlidir. Kanser tedavileri araştırmacılar, moleküler görüntüleme, inflamasyon, ve diğer alanlarda IVIL yöntemi yararlı bilgiler sağlar bulabilirsiniz.
