Mikro-desenleme çok güçlü bir araçtır çünkü hücrelerin canlı organizmalarda karşılaştıkları biyokimyasal ve biyofiziksel sinyalleri tanımlamak için hücresel tepkilerin incelenmesine olanak sağlar. Diğer yöntemlerin aksine, açıklanan desen üretimi için daha esnektir. Örneğin, yüksek tekrarlanabilirlik ile birden fazla protein degradeler ve mikro-desenler üretimi sağlar.
Grubumuz limap'i sadece nöronal yol bulma çalışmaları için değil, aynı zamanda diğer hücrelerin hücre çoğalması, farklılaşması ve göçü üzerinde etkisi olan sinyallere nasıl tepki verdiğini de inceler. Mikro-desenleme hücre biyolojisi temel sorulara cevap için kullanılır. Kazanılan bilgi rejeneratif tıpta mevcut cihazları değiştirmek için kullanılabilir, örneğin, periferik sinir hasarı sonrası sinir onarımı.
Dijital çizim yazılımı nda desenleme için şablonlar tasarlayarak başlayın. 1, 824 piksel uzunluğunda ve 1, 140 piksel genişliğinde bir görüntü boyutu seçin. Şablonu tasarla ve şablonu 8 bit TIFF dosyası olarak kaydedin.
Desenlemeden önce, 1,000 ila 1, 300 militorr proses basıncı ve bir ila beş dakika boyunca 29,6 watt güç kullanarak yüzeyi plazma temizleyiciile temizleyin ve etkinleştirin. 20 milimetrelik iç kuyu boyutu ve 0,16 ila 0,19 milimetre cam kalınlığı ile bir cam alt çanak kullanın. Test edilen koşulların sayısına bağlı olarak altı kuyulu veya tek kuyulu bir yemek seçin.
İç cam alt kuyuya sığdığından emin olmak için steril koşullar altında PDMS şablonlarını kesin. Steril forceps ile iç mikrokuyu dolgular çıkarın ve iyi cam şablonları sopa. PBS'de mililitre başına 0,1 miligramlık PLL-PEG çözeltisi hazırlayın ve her mikrokuyuya 20 mikrolitre ekleyin.
Daha sonra, bir saat oda sıcaklığında çanak kuluçka. Kuluçkadan sonra, her kuyudan 15 mikrolitre PLL-PEG çıkarın ve kurumasına izin vermeden 20 mikrolitre PBS ile beş kez yıkayın. Tek bir kuyudan 18 mikrolitre PBS'yi çıkararak ve beş mikrolitre fotoinitiator ekleyerek pbs'yi kalan mikrowelllerde bırakarak bir referans deseni oluşturmak için bir mikrokuyu hazırlayın.
Ardından, boş bir iç cam kuyusu işaretlemek için floresan vurgulayıcı kullanın. Çok fazla hedefi yerleştirin ve PRIMO logosu ve sloganı hücrelerinizin dikkatini çekinceye kadar objektif odağı ayarlayın" dedi. Ardından, odak düzleminin Z konumunu kaydedin.
Bir referans deseni oluşturmak için, kamera aracılığıyla iletilen ışığı kullanarak fotobaşlatıcı ile mikrokuyu kenarını görselleştirin ve sağ menüden YG simgesini seçin. Tasarım birimi olarak Yatırım Getirisi'ne yansıtılacak istenilen desen şablonu şablonuna yüklemek için PRIMO'yu seçin. Microwell'in çevresel bölgesine gidin, Kilit'i seçin ve odağı Kalibrasyonun Z konumuna ayarlayın.
Ardından, başvuru desenini fotoğraflandırmaya başlamak için Oynat'ı seçin. Fotoinitiator kaldırmak için 20 mikrolitre PBS ile referans deseni microwell üç kez yıkayın. Daha sonra, floresan olarak etiketlenmiş ekstrasellüler matriks veya ECM, protein çözeltisi 20 mikrolitre ekleyin.
Kabı oda sıcaklığında 10 ila 20 dakika kuluçkaya yatırın ve referansı ışıktan iyi koruduğundan emin olun. Kuluçkadan sonra, 18 mikrolitre protein çözeltisini çıkarın ve kuyuyu 20 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Referans desenini görselleştirmek için epifloresan mikroskobu kullanın.
Kamera yolundaki desen kenarlarına odaklanmayı ayarlayın ve Z konumunu en iyi netmeye göre kaydedin. Bu pozisyon sonraki desenleme için kullanılan en uygun lazer odak noktası olacaktır. Steril koşullarda, tüm mikrokuyulardan 18 mikrolitre PBS çıkarın.
Her kuyuya beş mikrolitre fotoinitiator ekleyin ve yukarı ve aşağı borular oluşturarak homojenize. Aynı mikrokuyuda birden fazla protein desenleniyorsanız, istediğiniz desen şablonlarının tümlerini aynı anda yükleyin. Ardından, satır, sütun ve doz sayısını seçin.
Şablon yapılandırmasını yazılımda dosya olarak kaydedin. Başvuru deseninin üretildiği alana gidin ve odağı en uygun Z konumuna ayarlayın. Ardından, fotodesen başlatmayı başlatmak için Oynat'ı seçin.
Fotodesenleme tamamlandıkça tasarım birimleri kırmızıdan maviye döner. 20 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayarak fotoinitiator'u mikrowelllerden çıkarın. Son yıkamadan sonra, her mikrokuyudan 18 mikrolitre PBS çıkarın ve 20 mikrolitre ECM protein çözeltisi ekleyin.
Çanak oda sıcaklığında 20-30 dakika kuluçkaya yatarak ışıktan koruduğundan emin olun. Daha sonra, ECM protein çözeltisinin 15 mikrolitresini çıkarın ve 20 mikrolitre PBS kullanarak mikrokuyuları üç kez yıkayın. Çapraz bağlamayı önlemek için, mikrowelllere 20 mikrolitre PLL-PEG veya BSA ekleyin ve çanak oda sıcaklığında karanlıkta bir saat kuluçkaya yatırın.
Daha sonra, bloke edici madde15 mikrolitre çıkarın ve PBS 20 mikrolitre ile üç kez tüm mikrowells yıkayın. 18 mikrolitre PBS'yi çıkarın ve her mikrokuyuya 5 mikrolitre fotoinitiator ekleyin, böylece fotoinitiator mikrokuyuların tüm yüzeyinde homojendir. İlk mikro kuyuya gidin ve daha önce kaydedilmiş şablon yapılandırmasını yükleyin.
Ardından, ilk turdaki eylemleri deselect'i seçtiğinizden emin olmak için ikinci tur da kalıbı yapılacak eylemleri seçin. Fotodesenlemeden sonra PBS ile yıkayarak PLPP'yi çıkarın. Daha sonra, ikinci ECM protein çözeltisi ile 20 dakika kuluçka, ve PBS 20 mikrolitre ile mikrowells üç kez yıkayın.
Yazdırılan desenleri görselleştirmek ve görüntülemek için bir epifloresan mikroskobu kullanın. Hücreleri plaka hazır olduğunuzda, tüm mikrowells kapsayacak şekilde emin olun, iç cam iyi hücreleri ile orta bir mililitre ekleyin. Ve kültür çanasını 37 derece santigrat ve %5 karbondioksit kuvöze yerleştirin.
Oluşturulan desenlerin şablonun kesin bir temsili olduğundan emin olmak için, floresan yoğunluk ölçümleri şeritler boyunca ve her şeridin üzerinde karşılık gelen bir arka plan bölgesinden elde edilir. Çoğaltılabilir tanımlanmış mikro desenler 20 ila 2 mikrometre genişliğinde elde edilir, ancak baskı özellikleri 20 mikrometre veya daha geniş olduğunda bir kenar etkisi gözlemlenebilir. Tanımlanmış protein konsantrasyonları ya değişen protein konsantrasyonları ile kuluçka ya da antiadhesif film cleave için kullanılan lazer dozu değiştirerek elde edilir.
Lazer yoğunluğu şablonun gri tonlama düzeyi ile orantılıdır ve UV aydınlatma gradyanları oluşturur. Degrade şeridi boyunca floresan yoğunluk profilinin ölçümü, desen şablonunda ve oluşturulan degrade deseninde doğrusaldır. Bu protokol, fibronektin yatay şeritler ile çapraz desenler gibi aynı mikrokuyuda birden fazla protein ile mikro desenler oluşturmak için kullanılabilir, ve laminin dikey şeritler.
Ancak proteinlerin çapraz bağlanmasını önlemek için bir engelleme adımı gereklidir. Oluşturulan çapraz desenler daha sonra nöronal hücre hatları ile hücresel tahliller için kullanılabilir, veya CAD hücreleri, ya da birincil nöronlar, sıçan DRGs. Bu protokolü gerçekleştirirken hatırlanması gereken en önemli hususlar uygun bir sistem kalibrasyonu yapmak, birden fazla yıkama adımında mikrokuyuların kurumasına izin vermemek ve protein kuluçka ve tıkama için doğru parametreleri kullanmaktır.
Hücre davranışının analizi genellikle floresan, zaman atlamalı, AFM gibi mikroskopi içerir. Daha fazla karakterizasyon gen ekspresyonu profilleme gibi diğer biyokimyasal yöntemleri kapsabilir.
