İyon hareketliliği kütle spektrometresi veya IM-MS, pH'ya bağlı redoks ve peptidlerin metil bağlama reaksiyonundan çeşitli ürün iyonlarını tanımlar. Üçüncül yapılarının moleküler modellemesi ile metal korelasyonları belirlenebilir. IM-MS, ürün iyonlarının her birini çözebilir ve aynı anda kütle-şarj ve varış sürelerini ölçerek ve stokiyometrileri, protonasyon durumları ve konformasyonel yapıları ile ilgili olarak moleküler bileşimlerini belirleyebilir.
Metal şelat peptidler sınıfları geliştirme metal iyon dengesizliği ile ilişkili hastalıklar için terapötik yol yardımcı olacaktır, Menkes ve Wilson hastalığı gibi, kanserler, ve Alzheimer hastalığı. Başlamak için, ESI giriş tüp ve iğne kılcal iyice yaklaşık 500 mikrolitre 0.1 molar buzul asetik asit, 0.1 molar amonyum hidroksit ve son olarak, deiyonize su ile temizleyin. 10 ppm poli-DL-alanin çözeltisinin negatif ve pozitif iyon IM-MS spektrumlarını her biri 10 dakika boyunca toplamak için metin protokolünde açıklandığı gibi yerel ESI-IM-MS koşullarını kullanın.
Pipet 200.0 mikrolitre 0.125 milimolar alternatif metanobactin, veya amb çözeltisi, bir içine 1.7 mililitre flakon. 500 mikrolitre deiyonize su ile seyreltin ve çözeltiyi iyice karıştırın. 1,0 molar asetik asit çözeltisi 50 mikrolitre ekleyerek numunenin pH'ını 3,0'a ayarlayın.
PH ayarlı numuneye 0,125 milimolar metal iyonun 200,0 mikrolitresini ekleyin. Daha sonra, numunenin 1,00 mililitrelik son hacmini elde etmek için deiyonize su ekleyin. Iyice karıştırın ve örnek oda sıcaklığında 10 dakika boyunca dengelemek için izin verin.
Künt bir burun şırıngası kullanarak, numunenin 500 mikrolitresini alın ve negatif ve pozitif iyon ESI-IM-MS spektrumlarını her biri beş dakika toplayın. Kalibre edilmiş mikro pH elektrotunu kullanarak son pH'ını kaydetmek için numunenin kalan 500 mikrolitresini kullanın. Yeni hacimlerde asetik asit veya amonyum hidroksit çözeltisi ekleyerek pH'ı dört, beş, altı, yedi, sekiz, dokuz veya 10'a ayarlamak dışında bu adımları yineleyin.
Ortaya çıkan çözeltilerin negatif ve pozitif iyon ESI-IM-MS spektrumlarını her biri 10 dakika toplayın. IM-MS spektrumlarından, alternatif metanobakinin hangi yüklü türlerinin teorik kütleden yüke izotop desenleriyle eşleştirerek mevcut olduğunu belirleyin. Bunu yapmak için MassLynx'i açın ve Kromatogram penceresini açmak için Kromatogram'ı tıklatın.
IM-MS veri dosyasını bulmak ve açmak için Dosya menüsüne gidin ve Açın. IM-MS spektrumuna sağ tıklayarak, kromatogramı sürükleyerek ve serbest bırakarak ayıklayın. Spektrum penceresi, IM-MS spektrumu gösteren açılacaktır.
Spektrum penceresinde, Araçlar ve Izotop Modeli'ni tıklatın. Izotop modelleme penceresinde, amb türünün moleküler formülünü girin, Yüklü iyon kutusunu Göster'i işaretleyin ve şarj durumuna girin. Tamam'ı tıklatın. IM-MS spektrumundaki tüm türleri tanımlamak ve kütleden şarja izotop aralıklarını kaydetmek için bu işlemi tekrarlayın.
Her amb türü için, herhangi bir rastlantısal kütleden şarja türü ayırın ve onları tanımlamak için kütleden şarja izotop desenlerini kullanarak varış zaman dağılımlarını veya ATD'leri ayıklayın. DriftScope'u açın ve IM-MS veri dosyasını bulup açmak için Dosya ve Aç'a tıklayın. Fareyi ve sol tıklatmayı kullanarak amb türünün topluizotop desenini yakınlaştırın.
Izotop deseni seçmek için Seçim Aracı'nı ve sol fare düğmesini kullanın. Geçerli seçimi kabul et düğmesini tıklatın. Herhangi bir rastlantısal kütleden şarjtürü ayırmak için, amb türünün izotop deseniyle hizalanmış ATD saatini seçmek için Seçim Aracı'nı ve sol fare düğmesini kullanın.
Geçerli seçimi kabul et düğmesini tıklatın. ATD'yi dışa aktarmak için, File'a gidin, MassLynx'e aktarın. Ardından Drift Süresini Koru'yu seçin ve dosyayı uygun klasöre kaydedin.
MassLynx'in Kromatogram penceresinde, kaydedilen dışa aktarılan dosyayı açın. İşleme'yi tıklatın, menüden Tümleştir'i tıklatın, ApexTrack Peak Tümleştirme kutusunu işaretleyin ve Tamam'ı tıklatın. CENTroid'i ve ATD'nin entegre alanını kaydedin. Tüm kaydedilmiş amb ve poli-DL-alanine IM-MS veri dosyaları için bu işlemi tekrarladıktan sonra, her titrasyon noktasındaki pozitif veya negatif iyonların tüm çıkarılan amb türleri için entegre ATD'yi kullanarak göreceli bir yüzde ölçeğine normalleştirin.
Bunu yapmak için, amb türlerinin kimliklerini ve her pH'daki entegre ATD'lerini bir elektronik tabloya girin. Her pH için, tek tek amb türlerinIN ATD'sini yüzde ölçeğine göre normalleştirmek için tümleşik ATD'lerin toplamını kullanın. Her amb türün pH'a karşı yüzde yoğunluklarını çizin, her türün popülasyonunun pH'ın bir fonksiyonu olarak nasıl değiştiğini gösterin.
Bir elektronik tablo kullanarak, helyum tampon gazı ile ölçülen poli-DL-alanin negatif ve pozitif iyonların çarpışma kesitlerini düzeltilmiş çarpışma kesitlerine dönüştürün. Daha sonra, poli-DL-alanine kalirantların ve amb türlerinin ortalama varış sürelerini sürüklenme sürelerine dönüştürün. Poly-DL-alanine calibrants'ın sürüklenme sürelerini düzeltilmiş çarpışma kesitlerine karşı takın.
Daha sonra, en az karereyon sığması kullanarak, A asal ve b değerlerini belirleyin, asal sıcaklık, basınç ve elektrik alan parametreleri için düzeltme ve B IM aygıtının doğrusal olmayan etkisini telafi eder. Bu A asal ve B değerlerini santrifüj zaman değeri ile kullanarak, düzeltilmiş çarpışma kesitlerini ve bunların çarpışma kesitlerini belirleyin. Bu yöntem, gaussview ile Gaussian kullanarak yaklaşık% 2 tahmini mutlak hataları ile peptid türleri için çarpışma kesitleri sağlar, ve teori B3LYP LanL2DZ düzeyi, gözlenen kitle-şarj bir tür koordinasyon tüm olası türleri için geometri optimize conformers bulmak.
B3LYP LanL2DZ teori düzeyi Becke üç çevre hibrid fonksiyonel, Dunning temel seti ve elektron çekirdek potansiyelleri oluşur. Gaussian çıkış dosyasından optimize edilmiş kondiktörlerin her birinin termokimyasal analizlerini ayıklayın ve Sigma programından iyon ölçekli Lennard-Jones yöntemini kullanarak teorik çarpışma kesitlerini hesaplayın. En düşük serbest enerji konforbazından, im-MS ölçülen çarpışma kesiti ile aynı fikirde olan Lennard-Jones çarpışma kesitini hangi conformer'ın sergilediğini belirleyin.
Bu işlem, deneyde gözlenen konforyanlar için üçüncül yapıyı ve koordinasyon türünü tanımlar. Moleküler modelleme farklı metal şelat siteleri, cis ve trans peptit bağları, tuz köprüleri, hidrojen yapıştırma ve pi-katyon etkileşimleri ile konfordanların serbest enerji ve çarpışma kesitlerinin karşılaştırılmasını gerektirir. Alternatif metanobactin bir IM-MS çalışma pH bağımlı bir şekilde hem bakır ve çinko iyonları şelite gösterdi, ancak farklı reaksiyon mekanizmaları ve koordinasyon siteleri aracılığıyla.
Çinko(II)'nin altıdan büyük bir pH'ında, öncelikle çinko(II)'nin iki imidazol ve iki tiyatril tarafından tetrahedrally koordine edildiğini gösteren tek bir negatif yüklü kompleks oluşturduğu gözlendi. Bakır(II)bağlama bir disülfür köprü oluşturan tiyoller eşlik etti. Altıdan büyük bir pH'da, tek negatif yüklü bakır(II)kompleksi oluşmuştur, bu da imidazol ve iki deprotonated amid azotunun bakırı koordine ettiğini gösteren(II)Ancak, pH altının altında, bakır(II) ekleyerek, aynı zamanda tek pozitif yüklü bakır(I)kompleksini ve pH altının üzerindeki tek pozitif yüklü bakır(II)kompleksini oluşturmuştur.
Amb 2 ve amb four im-MS çalışmaları da bakır reaksiyonları inter-veya intramoleküler disülfür köprü, bakır (I)veya bakır (II) iyonları sayısı ve pH bir fonksiyonu olarak değişti deprotonasyon siteleri sayısı farklı ürünler verdiğini göstermektedir. Moleküler modelleme ile IM-MS sonucu alternatif metanodikinler tiyolit, imidazoller ve karboksiat grupları ile üç bakır (I) iyonları kadar koordine olabileceğini gösterdi. IM-MS enstrümantal ayarları, metinde açıklandığı gibi peptidlerin stoiyometrisini, yük dağılımlarını ve konformasyonel yapılarını korumak için dikkatle seçilmelidir.
Aspartik asitte tirozin gibi metal koordinasyonunu etkileyecek daha geniş bir boyut aralığının birleşimi, yapı ve fonksiyon arasındaki ilişkinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. Moleküler modelleme ile IM-MS proteinlerin konformasyonel yapılarını belirlemek için kristalografi ve NMR spektroskopihızlandırmak için alternatif teknikler haline gelmiştir, DNA, lipidler, ve kompleksleri.
