Lazer yakalama mikrodisyonunun gücünü kullanarak doğal ortamlarındaki belirli kemik hücrelerindeki gen ekspresyonunun analizini kullanmayı hiç düşündünmü? Burada, fare kemiklerinin kriyokesitlerinden yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmenizi sağlayacak bir protokol açıklıyoruz. Bu teknoloji, genetiği değiştirilmiş fare modellerinde veya hastalık modellerinde belirli kemik hücrelerindeki gen ekspresyonundaki değişiklikleri incelemek için harika bir araçtır.
Burada açıklanan protokol fare kemikleri üzerinde odaklanmıştır, ancak herhangi bir türdeki herhangi bir sert doku hücrelerinde bir gen ekspresyonunu yerinde incelemek için kullanılabilir. Bu prosedürü göstermek için yardımcı, Christiane Schueler, benim laboratuvar bir teknisyen olacak. Genel anestezi altında eksanguination tarafından fareler ötenazi sonra, hızla tüm femurlar kaldırın.
Çevredeki yumuşak dokuların uyluk temizlemek için bir neşter ve kağıt havlu kullanın. Daha sonra, katıştırma kalıbına optimum kesme sıcaklığı bileşiği dökün ve uyluk kemiğini gömme kalıplarının dibine yerleştirin. Snap sıvı nitrojen örnekleri dondurmak.
Örnekler tamamen dondurulduktan sonra folyoya sarın ve kuru buzda dondurucuya aktarın. Daha fazla işleme hazır olana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. İlk olarak, kriyostattaki sıcaklığı eksi 19 dereceye, blok tutucunun sıcaklığını eksi 17 dereceye ayarlayın.
Sonra, kriyostat iç aşağı silin 70% etanol ile. Sert dokular, cam slaytlar ve dondurucu içine uygun bir alet için tek kullanımlık bıçağı yerleştirin ve kesit süresince kriyostat içinde tutun. Kuru buzdaki donmuş doku bloğunu kriyostat'a aktarın ve en az 10 dakika boyunca dengede durmasını bekleyin.
Daha sonra, OK Kdoğru bloğunu kalıbın dışına itmek için katıştırma kalıbının altına basın. Bloğu ona yapıştıracak kadar OCT ortamı uygulayın ve OCT ortamı tamamen donana kadar bekleyin. Bundan sonra, blok tutucuyu nesne tutucuya yerleştirin ve yerinde sıkın.
Bıçağın konumunu ayarlayın ve numuneyi kaplayan OCT'yi kaldırmak için bloğu 15 mikrometrelik kesme artışlarında kırpın. Sekiz mikrometrelik kesitler oluşturacak şekilde kriyostat'ı ayarlayın ve atılacak olan 2-3 kriyokesiti kesin. Blok üzerine yapışkan film yerleştirin ve filmi bloğa uydurma aracını kullandı.
Şimdi, film tarafından bölüm tutarken, yavaş yavaş ve sabit hızda bir kesim yapmak. Örneğin erimesini önlemek için filmi kriyostat içinde kriyobar üzerinde önceden soğutulmuş cam bir kaydıraktan yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Daha kolay boyama için filmi cam slayta sabitlemek için bant kullanın.
Bir duman başlık olarak, metin protokolünde belirtildiği gibi etanol, RNase-free su ve buz üzerinde ksilen gerekli çözümleri hazırlamak. Bölümleri 30 saniye boyunca %95 etanol le inkübün. Daha sonra, dikkatle tamamen OCT kaldırmak için 30 saniye boyunca RNase içermeyen su bölümleri daldırma.
Daha sonra, 50 mikrolitre ticari LCM dondurulmuş kesit lekesi bölümüne dağıtın ve oda sıcaklığında 10 saniye kuluçkaya yatırın. Emici mendil kağıt üzerine slayt kenarını yerleştirerek bölümü drenaj. Herhangi bir fazla leke kaldırmak için 30 saniye boyunca% 100 etanol bölümü durulayın.
Kemik bölümlerini %100 etanol içeren ikinci bir tüpe 30 saniye batırın ve ardından 30 saniye boyunca %100 ksilene aktarın. Bir destek olarak kuru bir cam slayt üzerine yapıştırıcı film koyun, mümkün olduğunca düz film yerleştirmek için özen. Bundan sonra, filmin üzerine bir PET membran çerçeve slayt yerleştirin ve kısa bir süre filme takmak için membran üzerinde eldivenli bir parmak basın.
Bu örnek membran ve yapışkan film arasında sıkışmış olacaktır. Yapışkan film katlanmış veya kırışık olmamalı ve film ve membran arasında hiçbir hava kabarcıkları olmalıdır. Sahne sonu kapağı tutucuyu temizlemek için yüzey dekontaminantını kullanarak başlayın.
Slaytı slayt tutucuya, kapakları da kapak tutucuya yükleyin. Ardından, odağı ayarlayın ve 1.25x hedefiyle slayta genel bakış elde edin. 40x hedefine değiştirin ve odağı ayarlayın.
Slayta genel bakışı kullanarak, ilgi alanını seçin. Daha sonra, her amaç için bu parametreleri optimize emin olmak, burada gösterildiği gibi lazer parametreleri ayarlayın. Lazer örneği kesmezse, lazer gücünü artırın.
Distal femoral veya kortikal kemikte morfolojik kriterlere göre osteoblast, osteoit ve kemik astar hücrelerini seçin. UV lazer tarafından hasarı en aza indirmek için hedef hücrelerden daha uzak lazer yolu için bir çizgi çizin. Lazer örneği kesmek için başarısız olursa, lazer birden fazla kez uygulayın veya eksik kesik noktalar için hedef incelemek ve bu noktalar doku kesmek için hareket ve kesme seçeneği kullanın.
Ayrı bir 0.5 mililitrelik tüp kapağı her hücre tipi toplayın. İlk olarak, toplama tüpünün kapağına beta merkaptoetanol içeren 50 mikrolitre likit tampon dağıtın. Bir dakika boyunca kapağın içinde yukarı ve aşağı borulama tarafından örnek lyse.
Daha sonra, lysate aşağı spin ve tüp beta-mercaptoetanol içeren lysis tampon 00 mikrolitre ekleyin. Her slayt için, 350 mikrolitre likit tampon içeren beta merkaptoetanol içeren etiketli bir mikrosantrifüj tüp hazırlayın. RNA ayıklamak için LCM'den sonra kalan bölümleri kullanın.
Filmi membrandan dikkatlice ayırın ve lysis tamponunu birkaç kez yavaşça keserek numuneyi lyse layın. Daha sonra, kuru buz üzerine lysate örnekleri koyun ve eksi 80 santigrat derece onları saklayın. Devam etmeye hazır olduğunuzda, oda sıcaklığında lysates eritin.
Bundan sonra, toplama tüpleri lcm hasat hücrelerinden yeni 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpler imal ve üreticinin talimatlarına göre RNA ayıklayın lysates aktarın. Bu çalışmada fare uyluk kemiğinin kemik hücrelerinde gen ekspresyonu analizi için yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA elde etmek için bir LCM protokolü geliştirilmiştir. LCM, numune toplama için yerçekimi kullanan bir LCM sistemi kullanılarak gerçekleştirilir.
İzole RNA'nın verimi ve bütünlüğü mikrokapiller elektroforez kullanılarak ölçüldü. Farklı lizis protokolleri kullanılarak elde edilen RNA kalitesi ve miktarı arasındaki fark burada temsili jel ve elektroferogramlarda görülebilir. Örnek bir dakika boyunca kapakta yukarı ve aşağı borular halinde incelendiğinde, bir milimetre kare mikrodisected kemik dokusundan yaklaşık 8,5 nanogram RNA izole etmek mümkündür.
RIN değeri 8.60'tır. Alternatif olarak, LCM, malzemeyi sarkan yapışkan kapağın içine mancınık yapan, odaklanmış lazer darbesi kullanan bir LCM sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. Taze donmuş kemikler için, mikrodissected kemik dokusunun bir milimetre kare yaklaşık 1.6 nanogram RNA izole etmek mümkündür.
RIN değeri birdir. Sonuç olarak, bu prosedürde hatırlanması gereken en önemli şey, ayakta protokolünü doğru şekilde uygulamak, sandviç kompleksindeki bölümlerin tamamen kurumasını önlemek, uygun bir LCM sistemi kullanmak ve hücrelerin hasat için zaman sınırlarını aşmamaktır. Yakalanan hücrelerden RNA'yı yalıtın, ifade profilleme için RNA'yı kullanabilirsiniz, örneğin, RNA araması ile.
Son olarak, ksilen ve beta-merkaptoetanol bir başlık altında ele alınması gereken tehlikeli maddeler olduğunu hatırlatmak istiyorum. Buna ek olarak, sıvı nitrojen ve ayrıca kriyotom bıçakları kullanırken uygun önlemleri alın.
