Bu yöntem, düşük demir koşullarında Mycobacterium tuberculosis'in kültürlendirilmesine ve membran veziküllerinin düşük demir kültürü filtratından arındırılmasına izin verir. Demir sınırlama membran vezikül üretimini teşvik etmek için bilinen olduğundan, bu protokol daha fazla biyokimyasal veya fonksiyonel tahliller için kullanılabilir saf membran veziküller yüksek bolluk verir. Biz Mycobacterium smegmatis kullanarak protokolü göstermek, nonvirulent suşu, Bu protokol Mycobacterium tuberculosis kullanarak BSL-2 tesislerinde takip edilebilir, öldürücü suşu.
Başlamak için, monopotasyum fosfat beş gram eriterek minimal orta bir litre hazırlamak, L-asparagine beş gram, gliserol 20 mililitre, ve dextrose iki gram plastik bir kapta deiyonize su 900 mililitre. Beş normal sodyum hidroksit ile pH'ı 6,8'e ayarlayın ve hacmi deiyonize suyla bir litreye ayarlayın. Sonra metal şelat rekarne 50 gram ekleyin ve yavaşça dört derece santigrat 24 saat boyunca bir manyetik karıştırma çubuğu kullanarak çalkalayın.
Ertesi gün, karıştırma durdurmak ve yaklaşık 30 dakika resinyon tortu sağlar. Plastik alıcılı 22 mikron filtre ünitesi nden filtrasyon yaparak kalan reçiyiyi sterilize edin ve çözeltiden çıkarın. Şimdi, çinko klorür litre başına 0.5 miligram ile ek minimal orta, magnezyum sülfat litre başına 40 miligram, ve manganez sülfat litre başına 0.1 miligram.
ADN zenginleştirme ile desteklenen mikobakteriyel et suyu orta iki mililitre MTB tek bir koloni aşılamak. 37 santigrat derecede ajitasyon la kuluçkaya yat. Görünür büyüme olduğunda, kültürün iki mililitresini ayıklayın ve OD 540'ı spektrofotometrede ölçün.
OD 540 0.8'e ulaştığında geç logaritmik fazı gösteren kuluçkayı durdurun. 0.2 gliserol, %0.5 Tween 80 ve ADN ile desteklenen mikobakteriyel agar plakaları üzerine geç logaritmik kültürün 200 mikrolitre yayılır. En az beş tabak aşılamak.
Plakaları 37 derecede kuluçkaya yatırın. Ve bir hafta sonra, bakteri üremesi bir konfluent tabaka olarak görülebilir. Sonra düşük demir minimal ortamda steril bir pamuklu bez ıslak.
Agar plakaları bakteri toplamak için bu bezi kullanın. Bakterileri 100 mililitre düşük demir minimal media ile bir tüpe aşılamak. Bir OD 540 bir süspansiyon hazırlamak için yeterli bakteri toplamak.
Düşük demir minimal orta ile bir litre süspansiyon 10 kez seyreltin ve iki steril plastik şişe içine bölün. Sonra, kültürün iki mililitresini beş mililitrelik bir kültür tüpüne aktarın. Hacim tyloxapol tarafından% 10 hacim10 mikrolitre ekleyin.
Kültürleri 14 gün boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kültürü 20 santigrat derecede yedi dakika boyunca 2, 850 kez g'de beş adet 225 mililitrelik konik santrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın. 50 mililitrelik pipet ile kültür supernatant toplamak ve filtre 0,22 mikron filtre ile sterilize.
MEV'leri izole etmek için, kültür filtrasyonunu dört santigrat derecede yerleştirilen karıştırılmış bir hücre ultrafiltrasyon sistemine aktarın ve konsantreyi 100 kilodalton kesme membranından 50 PSI'den daha düşük bir basınçta filtreleyin. Sonra 15, 000 kez g dört santigrat derece 15 dakika ve polikarbonat ultrasantrifüj tüplerde supernatant toplamak konsantre kültür filtrasyon santrifüj. Supernatant'ı 100,000 kez g'de dört santigrat derecede iki saat için santrifüj edin.
Bundan sonra, supernatant çıkarın ve nazik pipetleme ile steril PBS toplam bir mililitre membranöz pelet resuspend. Bir polipropilen ince duvarlı ultracentrifuge tüp altında% 60 iodixanol çözeltisi 1.5 mililitre ile pelet süspansiyon 0.5 mililitre karıştırın. Bindirme bu MVE iodixanol 45%süspansiyon bir mililitre ile 40%35%30%25 ve 20% iodixanol çözeltileri ve üst PBS bir mililitre.
Santrifüj 100, 000 kez g 18 saat boyunca 4 santigrat derece. Sonra, üstten başlayarak bir mililitre yoğunluk gradyan kesirleri toplamak için bir mililitre Hamilton şırınga kullanın. PBS ve santrifüj ile 20 mililitre ye kadar toplanan fraksiyonu 100, 000 kez g iki saat boyunca dört santigrat derecede seyreltin.
Supernatant çıkarın ve PBS 0,5 mililitre resuspend. Tüpleri dört santigrat derecede saklayın. Membran lipid analizi yapmak için, 96-iyi siyah plaka her kuyuda PBS 50 mikrolitre mililitre başına bir mikrogram son konsantrasyonda floresan membran probu TMA-DPH ile her degrade fraksiyonu 10 mikrolitre birleştirir.
Plakaları 33 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın. Floresan'ı uyarma için 360 nanometre ve emisyon için 430 nanometre olarak ölçün. Bu protokolde, MEV'ler yoğunluk gradyandisinde diferansiyel sedimantasyon ile saflaştırılmıştı.
Açıklanan koşullar altında, MEV'ler çoğunlukla %25 iyodixanol'e karşılık gelen üç. Vezikül ilişkili proteinler nokta lekesi analizi ile gösterilen kesir üç oranında yoğunlaşmıştır. Negatif boyama da üçüncü kesirde MEV'lerin varlığını doğruladı ve nanopartikül analizi MEV boyutunun 100 nanometre civarında olduğunu gösterdi.
Koloni oluşturan birimlere normalleştirilen protein ve lipid konsantrasyonu, yüksek demir koşullarına göre düşük demirde MEV veriminde yaklaşık sekiz kat artış gösterdi. Nokta blot analizi, demir sınırlı MTB kültüründen yoğunluk gradyan fraksiyonlarında MEV ile ilişkili belirteçlerden gelen daha yoğun bir sinyalin demir yeterli MTB kültürlerinden daha fazla olduğunu göstermiştir. Demir sınırlı koşulları sağlamak ve membran veziküllerinin lipoprotein agregaları ile kirlenmesini önlemek için minimal ortamın hazırlanması için talimatları uygulayın.
Bu şekilde saflaştırılan mikobakteriyel membran veziküller biyokimyasal karakterizasyon ve fonksiyonel analiz için kullanılabilir.
