Kemik metastatik prostat kanserinin seri 3Boyutlu hasta kaynaklı organoidlerini oluşturmak için stratejileri ve adım adım protokolleri tanımlıyoruz. Optimize edilmiş protokollerimiz, doğrudan hastalardan veya hasta kaynaklı ksenogreft tümör dokularından sınırlı başlangıç materyali kullanarak deneyler için 3Boyutlu kültürler kurmak için pratiktir. Bu protokolden 3D organoidler kemik metastatik prostat kanseri patolojisinin temel mekanizmalarını anlamak ve tedaviyi test etmek için ex vivo modelleri olarak kullanılabilir.
Bu protokoldeki 3D organoid kültür ortamı prostat kaynaklı hücrelere özgüdür. Protokollerimizin diğer bölümleri farklı tümör dokuları ve metastatik bölgeler için geçerlidir. Doming tekniği bu sürecin en zor parçası olarak kanıtlamak olabilir.
Doming tekniğinin pratik organoidler, medya ve Matrigel kubbeli karışımı tutarlı bir boyut sağlayacak ve örnek süspansiyon sırasında kabarcık oluşumunu en aza indirmek. Bu yöntemi görsel olarak göstermek, düşük yoğunluklu organoidleri düşük sayıdaki hücreden başarıyla elde etmek için viskoz Matrigel'in nasıl işleyeceğinidaha iyi anlamamızı sağlar. 24 kuyulu bir plaka kurulumu için hücre peletini uygun bodrum zarında yeniden sulayarak başlayın.
Pipet yukarı ve aşağı yavaşça hücreleri resuspended olduğundan emin olmak için, sonra önceden ısıtılmış doku kültür plaka merkezine hücre süspansiyon uygun hacmi pipet. Plakaters ve hemen hücre kültürü kuluçka seti baş aşağı yerleştirin 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 15 dakika. Pipet her kuyuya 10 mikromolar Y-27632 dihidroklorür içeren önceden ısıtılmış ortam uygun hacmi.
Ekli yuvarlak kubbeden yüzen bir kubbe oluşturmak için kubbeyi bir hücre kazıyıcı kullanarak plakadan ayırın. Parafin film bir iki dört inç parça kesin ve bir mililitre plastik pipet ucu kutusundan raf tutan boş bir ucu divots üstüne yerleştirin. Parafin filmine nazikçe basmak için eldivenli bir işaret parmağı kullanın ve filmi kırmamaya özen gösterdi.
Sprey parafin filmi% 70 etanol ile ve en az 30 dakika boyunca hazırlanan film sterilize etmek için hücre kültürü başlık UV lambası açın. Bu arada, bazal membran 20 mikrolitre önceden işlenmiş hücreleri askıya. Sonra parafin filminde oluşan divots içine süspansiyon pipet.
Katılaşmış boncukları ve parafin filmini altı kuyulu bir tabağa ve pipete 3-5 mililitre önceden ısıtılmış ortama yerleştirin ve parafin filminden boncukları hafifçe fırçalarken her kuyuya 10 mikromolar Y-27632 dihidroklorür içeren bir ortam yerleştirin. Histoloji için organoidler işlemek için, kuyudan bodrum membran kubbeler aspire değil özen mevcut medya kaldırın. Eşit hacimli hücre kurtarma çözeltisi ekleyin ve plakayı 4 santigrat derecede 60 dakika kuluçkaya yatırın.
Kuluçkadan sonra, bir pipet kullanarak bodrum membran kubbe çıkarmak ve bir pipet ucu ile ezmek. Ayrıştırılmış kubbeyi ve hücre kurtarma çözeltisini 1,5 mililitrelik bir tüpe toplayın. Tüpü 4 santigrat derecede 300 kez 5 dakika santrifüj edin, sonra süpernatantı çıkarın ve bir kenara koyun.
Organoidlerin varlığı istenilen soğuk PBS hacminde onaylandığında son adıma kadar tüm supernatants kaydedin ve hafifçe pipet yukarı ve aşağı mekanik organoidler bozmadan pelet çıkarmak için. Santrifüjtekrar layın ve supernatant çıkarın. Peleti oda sıcaklığında 60 dakika boyunca %4 PFA'lık uyumlu bir hacimde sabitleyin.
Fiksasyondan sonra santrifüj adımını ve PBS yıkamayı tekrarlayın. Sonra yavaş yavaş sıcak 2% agarose 200 mikrolitre ekleyin ve hemen ama yavaşça bir mililitre şırınga bağlı bir 25 gauge iğne kullanarak bozmadan tüp duvardan hücre pelet ayırmak. Agarose spin down yöntemi için, 25 gauge iğne kullanarak agarose ekledikten hemen sonra tüp duvarından hücre pelet ayırmak için önemlidir.
Agarose tamamen katıladıktan sonra, bir mililitreşile bağlı 25 kalibrelik bir iğne ile tüpten ayırın ve yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Tüp% 70 etanol ile doldurun ve doku dehidratasyon ve parafin gömme için geleneksel protokol ile devam edin. Bu protokol, kemik metastatik prostat kanserinin hasta kaynaklı ksenogreft modellerinden ve doğrudan kanser dokusundan 3Boyutlu organoidler oluşturmak için başarıyla kullanılmıştır.
Organoidler kistler, sferoidler ve daha yüksek karmaşıklık organoidler olarak tezahür farklı fenotipleri gösterdi. 25 yüksek çözünürlüklü, 10X büyütme görüntüleri dikişli bir görüntü de bodrum membran ve organoidlerin bütün bir kubbe görülebilir. Tümör dokusunu daha fazla araştırmak için, bazal epitel hücre belirteç sitokeratin-5, luminal epitel hücre belirteç sitokeratin-8 ve DAPI hedefleyen organoidlerin beş mikrometre kalınlığında parafin bölümüne immünfloresan sitokimya uygulandı.
Bu protokol, 3D organoidlerin özelliklerini ve ilaç tedavilerinin etkilerini keşfetmek için Batı lekeleme, eş kültür ve akış sitometrisi gibi diğer uygulamalar için optimize edilebilir. Bu deneyler ilaç direnci mekanizmaları ve yeni terapötik lerin etkinliğini tek başına veya mevcut tedaviler ile birlikte ele alabilir. Bu teknikten 3Boyutlu organoidler inter-konu ve intra-konu heterojenliğini korurlar ve bu nedenle hastalarda hastalığın daha doğru bir modelidir.
Bu teknik, araştırmacıların hastalarda hastalığın ilerlemesini ve tedaviye verdikleri yanıtı daha öngörülebilir hale getiren ilaç direnci, tümörigenez, metastaz ve tedavi mekanizmalarını keşfetmelerinin önünü açmaktadır.
