Zebra balığı homolog kromozom eşleştirme, sinaps ve rekombinasyon dahil olmak üzere meyozbölünme kromozom olayları incelemek için mükemmel bir omurgalı modeli olarak ortaya çıkmaktadır. Bu nükleer yüzey yayma protokolü süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak meyotik kromozom mimarisinin temel özelliklerini görselleştirmemizi sağladı. Araştırmacılar diğer zebra balığı yayma protokollerine göre daha az enkaz ile slayt başına iyi yayılmış çekirdekleri yüzlerce bekleyebilirsiniz.
Bu prosedürün teknik olarak en zorlu kısmı, deriye yakın olduğu ve diğer organlara bağlı olduğu için zebra balığı testislerinin diseksiyonudur. Diseksiyon prosedürünü görselleştirmek, araştırmacıların hayvanın dokusuna gömülü gonad'ı gördüklerinde ne beklemeleri gerektiğini bilmelerini sağlayacaktır. Erkek zebra balığı ötenazi sonra, küçük makas ile bir seferde bir balık decapitate ve sonra vücut boşluğu ortaya çıkarmak için ventral orta hat boyunca kesmek için mikro makas kullanın.
Bir silikon kaplı Petri kabına balık yerleştirin ve 1X PBS sığ bir havuz tarafından kapağı. 1.65X büyütme de bir mikroskop altında, forceps kullanarak testisler incelemek. Testislerden mümkün olduğunca çok yağ ve çevre dokuyu çıkarın.
Gonad, diseksiyon kapsamı ışığı altında yarı saydam görünürken, çevredeki yağ biraz daha koyu bir görünüme sahip olabilir. İşlemi engellemeden bir miktar yağ bırakılabilir. Her parçalanmış testisleri doğrudan beş mililitrelik bir tüp içine dMEM iki mililitre ile ekleyin ve buz üzerinde tutmak.
Testis hücrelerini ayrıştırmak için, testisler ile beş mililitrelik tüp kollajenaz çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin. Çözeltiyi birkaç kez ters çevirerek karıştırın. 32 santigrat derecede 100 RPM'de bir kuvöz çalkalayıcıda testisleri yavaşça sallayın.
Ayrışmayı kolaylaştırmak için tüpü her 10 dakikada bir hızla ters çevirin. Bir saat sonra, DMEM bulutlu ve testisler küçük parçalar halinde. Testisler kollajenaz içinde kuluçkaya yatarken, 100 mikrolitre 0.1 molar sakaroz çözeltisi 37 santigrat dereceye kadar ısıtılır.
Kollajenazyıkamak için, beş mililitre son bir hacim dmem ekleyin ve tüp birkaç kez ters. Pelet oda sıcaklığında üç dakika boyunca 200 g testisleri. Sadece iki mililitre kalması için süpernatantın üç mililitresini çıkarın.
DMEM yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Son DMEM yıkamadan sonra, dört mililitre süpernatant çıkarın ve bir mililitre DMEM, 200 mikrolitre tripsin çözeltisi ve 20 mikrolitre DNase I çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin.
100 RPM'de tüpü 32 derecede yatay olarak sallayın. Ayrışmayı kolaylaştırmak için tüpü her beş dakikada bir hızla ters çevirin. Beş ila 15 dakika sonra, DMEM çözümü yalnızca birkaç küme içerir.
Tripsin inhibitörü çözeltisinin 500 mikrolitresini ve 50 mikrolitre DNase I çözeltisini ekleyin. Tüpü karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin sonra kısa bir süre 200 g oda sıcaklığında üç dakika boyunca aşağı spin sıvı veya tüp kapağı veya tüp tarafına yapışabilir kümeleri kaldırmak için. Tüpü buza yerleştirin ve kalan kümelerin ayrışmasını kolaylaştırmak için tekrar tekrar plastik bir transfer pipetiyle iki dakika boyunca yukarı ve aşağı boru lar atarak hücre süspansiyonunu yeniden askıya alın.
Hücre süspansiyonunun transfer pipetinin ampulüne girmediğinden emin olun. Daha sonra DMEM ile 100 mikron hücreli bir süzgeç önceden ıslayın ve buz üzerinde 50 mililitrelik bir tüp üstüne yerleştirin. Plastik transfer pipeti kullanarak bir seferde bir damla süzgeç yoluyla hücre süspansiyon aktarın.
Yeni bir beş mililitrelik tüp için plastik transfer pipet kullanarak filtrat aktarın. Filtrenin alt tarafına bağlı havuzlu hücreleri topladığızdan emin olun. Beş mililitrelik son bir hacme tüpiçine DMEM ekleyin.
Hücreyi 200 g'da oda sıcaklığında beş dakika peletleyin. Peletrahatsız etmeden mümkün olduğunca çok supernatant çıkarın ve doğrudan pelet içine DNase I çözeltisi beş mikrolitre ekleyin. Daha sonra boş bir mikrosantrifüj tüp raf boyunca tüpün dış altını 4-5 kez hafifçe kazıyarak Pelet'i DNase I çözeltisi ile karıştırın.
DMEM'i son beş mililitrelik bir hacme ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek çözeltiyi karıştırın. Hücre süspansiyonuna 200 g'da oda sıcaklığında iki dakika pelet. DNase tedavisini, yeniden askıda olan pelet DMEM ilavesi üzerine kümelenmeden bir ila üç kez daha tekrarlayın.
Son spinsonra, pelet rahatsız etmeden mümkün olduğunca supernatant olarak kaldırın. Daha sonra, bir mililitre 1X PBS ekleyin ve boş bir tüp rafı boyunca tüpün dış altını hafifçe kazıyarak peleti yeniden askıya alın. Pelet hücre süspansiyon 200 g beş dakika ve sonra pelet rahatsız etmeden mümkün olduğunca çok supernatant çıkarın.
Diyafram genişletmek için 200 mikrolitrelik pipet ucu ucundan üç milimetre kesin. Kesme pipet ucu ile, yukarı ve aşağı borulama tarafından 0,1 molar sakaroz çözeltisi 80 mikrolitre pelet resuspend. Hücre süspansiyonu üç dakika oda sıcaklığında oturun.
Sonra, bir pipet ucu ile, 0,15% Triton X-100 ile% 1 formaldehit 100 mikrolitre ile bir slayt kat. Daha sonra sakaroz hücre süspansiyonunun 18 mikrolitresini uzun kenarına dik düz bir çizgide kaydırakın ortasına ekleyin. Hücre süspansiyonunun tüm köşelere yayılmasını kolaylaştırmak için kaydırağı ileri geri yatırın.
Formaldehit çözeltisinin kurumasını önlemek için slaytları hafifçe çatlamış açık nem odasına düz bir şekilde yerleştirin. Nem odasını bir gecede karanlık bir çekmeceye yerleştirin. Sabahları, kapağı nem odasından çıkarın ve slaytların tamamen kurumasını bekleyin.
Bir coplin kavanoza slaytlar yerleştirin ve sonra distile su ile coplin kavanoz doldurun. Oda sıcaklığında hafifçe sallayarak beş dakika kuluçka. Suyu dökün ve 1-250 ıslatma maddesi ile kavanozu doldurun.
Oda sıcaklığında hafifçe sallayarak beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Slaytların tamamen kurumasını ve lekeli olana kadar eksi 20 derecede saklamasına izin verin. Bu protokol, zebra balığı spermatosit yayılımı nın hazırlanması ve görselleştirilmesi için bir yöntem ortaya konmuş ve bu yöntem üst üste yayılmaz çekirdekleri ortaya attırılmıştır.
Soldaki paneller meiyotik profaz, leptoten, erken zigot ve pachytene üç aşamada göstermektedir. Telomerler her aşama için lekeli macenta idi. Yetersiz DNase I tedavileri nedeniyle düşük kaliteli yayılır bir örnek burada gösterilmiştir.
SYCP3 için boyanmış meyotik kromozomlar, hücrelerin slaytta düzgün bir şekilde yayılmasını engelleyen viskoz bir sakaroz hücre süspansiyonuna bağlı olarak örtüşen çekirdekleri gösterir. Doğru miktarda başlangıç materyali ile başlamak, zebra balığı testislerini tripsin'de uygun süre için tedavi etmek ve bunu yapmamak çok az çekirdek veya kümelenmiş çekirdeklere yol açabileceğinden gerekli sayıda DNase I tedavisini gerçekleştirmek çok önemlidir. Formaldehit ile çalışırken uygun PPE her zaman giyilmelidir.
Yayma işlemini takiben, kromozomlar çeşitli kromozom yapıları görselleştirmek için lekeli yanı sıra çift iplikçikli tatili zamanlaması bağımlılık ve meiyotik olayların lokalizasyonu analiz etmek için. Tekniğimiz, zebra balığının kromozom özelliklerine ve telomer buketine dayanarak fareden daha iyi bir insan spermatogenez modeli olabileceğini göstermenin yolunu açmıştır.
