Utero elektroporasyon çift farklı yerlerde ve gelişimsel yaşlarda üretilen nöron hücreleri arasındaki etkileşim gibi memeli kortikogenez önemli yönlerini incelemek için güçlü bir yöntemdir. Bu tekniğin en büyük avantajı, bu farklı hücre popülasyonları arasındaki tedirgin olmayan etkileşimleri hızlı, ayrıntılı ve ucuz bir şekilde inceleyebilme yeteneğidir. Yöntemimizin çarpıcı bir sonucu da, otizm ve şizofreni gibi nöronal bozukluklarda kablolamanın nasıl değiştirildiğinin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırıyor olmasıdır.
Bu çalışma neokorteks ile sınırlı değildir ama aynı zamanda hücre etkileşimleri hücre analiz etmek için istihdam edilebilir, sepalium veya beyincik gibi ekkorcortico alanlarda. En zorlu adımlardan biri erken embriyoların lateral ventriküllerine DNA enjeksiyonudur. Başarılı enjeksiyonlar için parlak bir ışık kaynağının kullanımı esastır.
Her ameliyat için ilk hızlı yeşil boya bir mikrolitre içeren 10 mikrolitre çözüm hazırlamak, her plazmid için ilgi mikrolitre plazmid DNA çözeltisi başına bir mikrogram, ve Endotoksin ücretsiz TE tampon uygun hacmi. Ve uygun hazırlanmış DNA çözeltisi ile bir cam mikrocapiller pipet önceden yükleyin. Rahim elektroporasyon cerrahisinde ilk kez, uygun zamanlanmış bir hamile farenin gözlerine merhem uygulayın ve karın tıraşı için bir jilet kullanın.
Karın sağ tarafında kesi ile devam etmeden önce ardışık% 70 etanol ve iyot mendil ile maruz kalan cilt iki kez dezenfekte. Rahim erişilebilir bir kez dikkatle organ ayıklamak için halka forceps kullanın. Bir ağız kontrollü aspiratör tüp kullanarak, strateji A.Or strateji B için E13.5 embriyoların sağ yarımkürenin lateral ventrikül içine E11.5 embriyoların sol yarımkürenin lateral ventrikül içine çözelti yaklaşık 0.5 mikrolitre enjekte, hızlı yeşil boya ventrikül içinde görünür kadar.
Tüm çözelti enjekte edildiğinde, plaseps tipi platin elektrotlar yanal enjekte embriyoların başının etrafında, pozitif kutup medial duvara strateji A için kortikal hem hedef odaklı, ya da strateji B için lateral korteks odaklı, kalp ve plasenta önlemek için özen. Tabloda belirtildiği gibi, her embriyonik yaş için uygun elektrik darbeleri dizisini uygulamak için bir kare dalga elektroporatör kullanın. Tüm embriyolar enjekte edilmiş ve elektroporated zaman, dikkatle karın boşluğuna rahim dönmek için forceps kullanın, ve sıcak tuzlu ile karın doldurun.
İğne kullanarak 6-0 dikiş, karın duvarını kapatın ve dikkatle deri kesisi kapatın. Sonra tam iyileşme kadar izleme ile ev kafesi için hayvan dönün. İlk ameliyattan iki gün sonra, farenin normal davranışlar sergilediğini ve ağrı veya sıkıntı belirtisi göstermediğini doğrulayın.
Sadece gösterildiği gibi rahim elektroporasyon ikinci için hayvan hazırlamadan önce. Strateji A için E13.5 embriyoların sol lateral beyin ventrikül içine istenen DNA çözeltisi 0.5 mikrolitre enjekte, ve strateji B.5 için E15.5 embriyoların sol lateral beyin ventrikül içine her enjeksiyondan sonra, strateji A ve strateji B.Andporate embriyolar için enjekte edilen yarımkürenin lateral korteksine yönelik pozitif kutup lu elektrotlar yerleştirin. Elektroporasyon bittiğinde, karın boşluğuna rahim dönmek ve ameliyat ve ameliyat sonrası bakım gösterildiği gibi tamamlamak.
Strateji A uygularken, ikinci elektroporasyon dört gün sonra, buz üzerinde PBS bir petri çanak içine embriyonik gün 17,5 hamile kadın fare rahim hasat. Ve embriyoları bir inceleme mikroskobu altında yeni bir PBS tabağına aktarmak için cımbız kullanın. Forceps kullanarak, dikkatle baş ve kafatası üzerinde deri kaldırılmasını kolaylaştırmak için her embriyonun başını kavramak.
Pozlanmış beyinleri çıkarmak için forseps veya spatula kullanın. Sonra iyi başına fiksatif çözelti yaklaşık 600 mikrolitre içeren bir 48 kuyu plaka bireysel kuyular içine her beyin aktarmak için kaşık kullanın. Tüm beyinler toplandığında, beyinleri bir gecede yörüngesel bir çalkalayıcıyla dört dereceye sabitle, ardından PBS'de üç on dakikalık yıkar.
Son yıkamadan sonra, yaklaşık on dakika boyunca PBS%4 düşük erime noktası agarose beyin gömmek. Agarose katılaşmış sonra, bir vibratom doku tutucu koku ampul yan her beyin güvenli siyanoakrilat tutkal kullanın. Tutucuyu vibratom kabının içine yerleştirin ve kabı PBS ile doldurun.
Sonra 100 mikrometre kalınlığında koronal seri bölümleri elde etmek için vibratom ve fırça kullanın. Kuyu başına yedi bölüme ve embriyo başına altı kuyuya, taze PBS kuyusu başına 600 mikrolitre içeren yeni bir 48 kuyu plakası, toplanan anti-mantar koruyucular ile desteklenmektedir. Tüm bölümler edinildiğinde, her bölümü cam mikroskop slaytına monte etmek için ince bir fırça kullanın ve dik epifloresan mikroskoptaki elektroporasyon etkinliğinin değerlendirilmesi için bunları cam bir kapak lı ile kapatın.
Strateji B uygularken, doğum sonrası gün 15, topinch yanıt eksikliği doğruladıktan sonra, supine pozisyonda fare güvenli, ve göğüs kafesi ve diyafram ortaya çıkarmak için bir orta hat deri kesi yapmak için makas kullanın, ve kalbe erişmek için diyafram kesti. Ince makas kullanarak, sağ atriyumda bir kesi yapmak, ve sol ventrikül nüfuz peristaltik perfüzyon pompası esnek bir tüp bağlı 25 gage iğne kullanın. İğne yerinde olduğunda, dakikada 5,5 mililitre sabit bir akı ile transkardiyal perfüzyon ile en az 25 mililitre 4% paraformaldehit teslim.
Yaklaşık beş dakika sonra, perfüzyon durdurmak ve baş üzerinde deri kaldırmak için makas kullanın. Kafatası çıkarın ve beyin dokusu kaldırmak için bir spatula kullanın. Bir orbital shaker üzerinde dört derece santigrat bir gecede kuluçka için taze% 4 paraformaldehit 1.5 mililitre içeren bir 24 kuyu plaka bir kuyu içine beyin yerleştirin.
Sonra az önce gösterildiği gibi doğum sonrası beyinlerin 40 mikrometrelik bölümlerini elde edin. Embriyonik ve doğum sonrası beyin dilimi görüntüleme için, bir mikroskop slayt tutucu üzerine ilgi monte beyin bölümleri içeren slaytlar yerleştirin. Kaydırıcı tutucuyu konfokal mikroskobun içinde tanıtın ve deneyde kullanılan floroforlar için uygun kanalı seçin.
Çift elektroporasyon çıkışının genel görünümü için her beyin bölümünün harita görüntülerini iki farklı dalga boyunda elde etmek için örnek tarama yapın. Tamamlandıktan sonra, çok alanlı Z-stack zaman atlamalı gözlem modunda 10x lensi seçin. Seçilen XY bölgelerinin her birinde, floresan görülebilen numunenin düzlemlerine göre z ekseni boyunca tarama derinliğinin yanı sıra uygun görüntüleme çevrelerini de ayarlayın.
Seçilen tüm bölgelerin düşük büyütme görüntülerini edinin ve görüntüleri mikroskop görüntüleyici yazılımında OIF'ten TIFF formatına aktarın. Sonra 60x lens seçin ve daha ayrıntılı bir düzeyde hücre-hücre etkileşimleri gözlemlemek için, sadece gösterildiği gibi yüksek büyütme görüntüleri yakalamak. Utero elektroporasyon ameliyatlarında çift arasındaki temporal boşluk, embriyonik gün 11.5'te hedeflenen CAG toreal hücrelerinin, somatosensoriyel alan da dahil olmak üzere lateral neokorteksin marjinal bölgesine ulaşması için menşe bölgelerinden birinde, embriyonik gün 13.5'te etiketlenmiş kortikal projeksiyon nöronları ile temas kurmak için zaman içinde izin verir.
Gelişmiş GFP ifade projeksiyon nöronların önde gelen süreçleri bol korteksmarjinal bölgesinde uprise, ve M-kiraz kataretzial hücrelerin ifade süreçleri ile iç içe. Embriyonik gün 13.5 de rahim elektroporasyon, plazmid ifade bir BFP kullanarak farklı kortikal tabakalar arasında projeksiyon nöronların etiketleme kolaylaştırır. Embriyonik gün kontralateral tarafında ikinci bir elektroporasyon 15.5 üst tabaka kalozal projeksiyon nöronlar alt popülasyon hedefliyor, ama daha erken aşamalarında geliştirmek alt tabaka projeksiyon nöronlar.
Üst tabaka hedeflenen nöronlar karakteristik ağaçlandırma deseni ile, kontralateral hemisfer aksonları genişletmek. Yüksek büyütme kontralateral hemisfer içinde hedeflenen projeksiyon nöronların kaçık akson innervasyonu daha ayrıntılı bir görselleştirme sağlar. Bu protokolü denerken, elektroporasyon zamanlaması, enjekte edilecek yarımküre ve hedeflenecek hücre popülasyonlarına göre elektrotların konumunu planlamak önemlidir.
Bu prosedürütaki tüm yöntemler, elektroporasyon gibi ilginç olandır. Her iki hücre tipi için vivo olası devre değişiklikleri çalışma yapılabilir. Bu tekniği kullanarak, iki farklı hedefli hücre arasındaki ince etkileşimleri incelemek mümkündür.
Floresan sinaptik proteinlerin elektroporasyonu ile vivo yeni bilim bilgileri dahil.
