Bu protokoller önemli araştırma araçları ve potansiyel terapötikler olan yeni HAT inhibitörlerinin gücünü ve seçiciliğini doğrulamak için ayrıntılı adımlar sağladıkları için önemlidir. Bu videoda gösterilen teknikleri gerçekleştirmek kolaydır ve küresel ve bölgesel histon asetilasyonu üzerine HAT inhibitörleri etkileri hakkında bilgi sağlar. Gen ekspresyonunun epigenetik düzenlemesini anlamalarını mümkün kılarlar.
Detaylara dikkat çok önemlidir. Protokolleri adım adım takip etmek önemlidir. El yazması talimatlara göre 0,2 mililitrelik bir PCR tüp içinde 10 mikrolitre hacimde enzimatik reaksiyon hazırlayarak başlayın.
Daha sonra tam reaksiyon karışımını 30 santigrat derecede bir PCR termal döngüde bir saat kuluçkaya yatırın. Bu arada, 6X SDS örnek tampon bir ila 10 oranında iki mercaptoethanol ekleyin. PCR termal döngücüden numuneleri çıkarın ve her reaksiyon karışımına hazırlanan SDS numune arabelleğinden iki mikrolitre ekleyin.
Numuneleri bir ısı bloğunda beş dakika boyunca 95 dereceye ısıtın, sonra buzda soğutun. Örnekleri eksi 20 veya eksi 80 santigrat derecede saklayın veya jel elektroforezi ve immünoblotting ile devam edin. Tohum 100, 000 MCF-7 hücreleri hücre kültürü orta bir mililitre içinde 12-iyi plaka her kuyuiçine ve hücrelerin% 80-90 biraraya büyümeye izin.
Hücreler istenilen biraraya ulaştığında, hücre kültürü ortamını dört, beş ve altı kuyulardan aspiratve pipet bir mililitre üç mikromolar MS275'in her kuyuya orta olarak yerleştirin. Daha sonra hücre kültürünü bir, iki ve üç kuyulardan aspire edin ve pipet bir mililitre seyreltilmiş DMSO'yu her kuyuya aspire edin. MS275'e maruz kalan hücrelerde asetillenmiş histones birikimine izin vermek için hücreleri dört saat boyunca kuvöze geri verin.
Hücreler kuluçkaya yatarken, el yazması yönlere göre DMSO'da A-485 seyreltmelerini hazırlayın. Kuluçka bittiğinde, kuyulardan orta aspire ve seyreltme ekleyin. Hücreleri kuvöze geri döndürün ve 20 saat boyunca kültürlendirin, sonra hücre kültür ortamını kuyulardan aspire edin ve hücreleri bir mililitre PBS ile yıkayın.
PBS aspire ve pasif lysis tampon 100 mikrolitre ekleyin. Plakayı bir gecede eksi 80 derecede saklayın. Pipet 100 mikrolitre dmso ile tedavi edilen hücrelerden iki 1,5 mililitrelik tüpler halinde, daha sonra pipet 400 mikrolitre ChIP seyreltme tampon her tüp için toplam hacmi 500 mikrolitreye kadar getirmek için.
Çözeltinin beş mikrolitresini tüplerden çıkarın ve DMSO girişi olarak eksi 20 derecede saklayın. Aynı şekilde A-485 ile tedavi hücrelerden sonicated kromatin ile iki tüp hazırlayın. DMSO ve A-485 örneklerine IgG ve H3K27 asetil antikorları eklemek için bir pipet kullanın.
Sonra her tüpe 20 mikrolitre protein ekleyin Bir manyetik boncuk, boncukların iyice askıya alınmasını sağlamak. Örnekleri bir gecede dört santigrat derecede döndürün. Pelet protein Manyetik ayırıcı kullanarak manyetik boncuklar ve boncukrahatsız etmeden supernatant kaldırın.
Boncukları 500 mikrolitre ile bir mililitre düşük tuz yıkama tamponu ile yıkayın ve dört santigrat derecede beş dakika döndürün. Hızlı bir spin aşağı gerçekleştirin, bir manyetik ayırıcı ile boncuk pelet ve supernatant kaldırın. Yüksek tuz yıkama tamponu, lityum klorür yıkama tamponu ve TE tamponu ile yıkama işlemini tekrarlayın.
TE tamponu ile yıkadıktan sonra, giriş örneklerini dondurucudan çıkarın ve buza koyun. Proteinaz K'nin bir aliquot'unu eritin, sonra da manyetik ayırıcı kullanarak boncukları peletleyip TE tamponu boncuklardan çıkarın. Giriş örnekleri de dahil olmak üzere her numuneye 100 mikrolitre ChIP elüsyon tamponu ve bir mikrolitre proteinaz K ekleyin ve bir termocycler kullanarak 62 derecede sallayarak iki saat boyunca tüplü olarak inkülersiniz.
Kuluçkadan sonra numuneleri 10 dakika boyunca 95 dereceye ısıtın, ardından oda sıcaklığında soğutun. Manyetik ayırıcı ile manyetik boncukpelet ve yeni bir 1.5 mililitrelik tüp için DNA içeren supernatant aktarın. Standart bir PCR temizleme kiti kullanarak DNA'yı arındırın ve qPCR çalıştırın.
In vitro histon asetiltransferaz tsay bir histon substrat doğru p300 HAT aktivitesi üzerinde anakardik asit etkisini araştırmak için kullanılmıştır. Bir konsantrasyon aralığı test edildi ve asetil-CoA negatif kontrol reaksiyonuna eklenmedi. İmmünoblot sonuçları ImageJ ile ölçüldü, DMSO kontrolüne göre 100 mikromolar anakardik asitte asetil H3K18 ve asetil H3K9'da belirgin bir azalma görüldü.
Kromatin hiper-asetilasyon inhibisyonu tetkikinde, McF-7 hücrelerinin HDACi MS275 ile tedavisi histonin insetazasyonu 3'ün çeşitli lizin kalıntıları üzerinde güçlü bir şekilde yükseltilmesi. Asetil H3K18 ve asetil H3K27 bazal düzeyleri düşüktü, ChHAI tsay bir HDACi eklemenin faydalarını gösteren. MS275 ile tedavi edilen hücrelerde A-485 eklenmesi H3K18 ve H3K27'de artmış histon asetiyonu zayıflatır, ancak H3K9'u zayıflatmamaktadır.
İmmünoblot sonuçları da ImageJ ile ölçüldü. ChIP qPCR onkogen ekspresyonu kontrol gen düzenleyici elemanları nda HAT inhibitörleri etkilerini araştırmak için kullanılmıştır. DMSO örneğinde, IgG kontrol antikortarafından çökeltilen DNA siklin D1 organizatörü için qPCR reaksiyonunda asetil H3K27 antikordan daha yüksek bir Ct değeri üretti, spesifik olmayan IgG kontrolünün promotördeki asetil H3K27 spesifik antikordan daha az DNA histon komplekslerine çöktüğünü gösteriyor.
DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında, A-485 siklin D1 organizatörü nde asetil H3K27 zenginleştirme azaltılmış. Daha da önemlisi, A-485 hücre kültüründe asetil H3K27 önemli ölçüde azaltmak bilinmektedir. Bu protokolü denerken, in vitro HAT ve ChHAI testlerinin kuluçka öncesi adımlarının gerekli olduğunu ve unutulmaması gerektiğini unutmayın.
Ayrıca giriş örneklerini kaydetmeyi ve ChIP sırasında boncuk kaybını önlemeyi unutmamak da önemlidir. Bu prosedürleri uyguladıktan sonra, ChIP-seq tüm genom için düzenleyici elementlerde histon asetilasyonu hakkında küresel bilgi elde etmek için yürütülebilir ek bir yöntemdir. Bu protokoller bilim adamları için dikkatle yeni HAT inhibitörleri doğrulamak ve literatürde düşük kaliteli kimyasal problar yayınlamaktan kaçınmak için yararlıdır.
Doğrulanmış HAT inhibitörleri potansiyel terapötik olarak daha fazla gelişme geçirebilir.
