A.J.C, J.A.T ve I.L, Horizon 2020 projesi ACEnano aracılığıyla Avrupa Komisyonu'ndan fon sağlamayı kabul ediyor (Hibe no. H2020-NMBP-2016-720952). W.Z, Çin Burs Konseyi'nden (CSC, No. 201507060011) doktora fonunu kabul eder. R.R, Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü'nün Vidi hibe programının finansal desteğini kabul etmektedir (NWO Vidi 723.0160330).

Leiden Üniversitesi ve Innsbruck Tıp Üniversitesi'nin IRB protokol yönergelerine göre insan biyofluid kullanımı onaylandı. İnsan veya hayvan biyokütleleri araştırılırken, araştırma kurumundan etik onay alınması gerekmektedir ve bu protokolde gösterilen sonuçlar durumunda elde edilmiştir. Ayrıca, gelecekteki çalışmalarda verilerin şeffaflığını ve yeniden kullanılabilirliğini sağlamak için yeterli raporlama da yapılmalıdır9,29,30.
1. Arka plan elektrolitlerinin hazırlanması (BGE)
NOT: Tüm çözücüler uygun bir duman kaputunda hazırlanmalı ve tüm adımlar (labcoat, eldiven ve gözlükler) için yeterli kişisel koruyucu ekipman kullanılmalıdır. Her adımda, numunenin züccaciyeden sızmış tuzlarla analit kaybını ve kirlenmesini en aza indirmek için düşük bağlayıcı plastik şişeler gereklidir.
<ol><li>Metabolomik için günlük olarak %10 asetik asit BGE (v/v), pH 2.2 hazırlayın.<ol>
<li>10 mL hacimsel şişeye 1 mL asetik asit ekleyin, ardından işaretli çizgiye deiyonize (DI) su eklenmesi ve iyice karıştırılması.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proteomik için günlük olarak 100 mM asetik asit, pH 2.9 hazırlayın.<ol>
<li>10 mL hacimsel şişeye 57 μL asetik asit ekleyin, ardından işaretli çizgiye DI suyu ekleyin ve iyice karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NM hazırlığı
<ol><li>Yayınlanan31, 32,33kılavuzlarını kullanarak NM'leri suya kuvvetlice dağıtin. NOT: Bu protokolün geliştirilmesinde 7 NM şu şekilde kullanılmıştır: Protein ve metabolit korona için sırasıyla 100 ve 1.000 nm karboksilat polistiren kullanılmıştır. Hem protein hem de metabolit koronalar için 100 nm değiştirilmemiş polistiren NM' ler, 13 nm anataz TiO2 NM'ler, hem protein hem de metabolit koronalar için değiştirilmemiş veya poliakrilat veya PVP polimerleri ile kaplanmış22 nm değiştirilmemiş SiO 2 NM'ler kullanılmıştır. Yöntem bu NM'ler kullanılarak geliştirilir ve gösterilirken, bu yaklaşımın çok çeşitli NM kompozisyonları, boyutları, şekilleri ve morfolojileri için geçerli olacağı belirtilmelidir.</li>
	<li>Dinamik ışık saçılımı kullanarak parçacık boyutunu karakterize34,35, tek parçacık endüktif olarak birbirine bağlı plazma kütle spektrometresi36, nanopartikül izleme analizi37veya iletim elektron mikroskopisi ve yüzey yükü zeta boyutu kullanarak zeta potansiyeliolarak 34.</li>
</ol>3. Biyomoleküler korona oluşumu
<ol><li>2 mL insan plazmasını (veya tercihi biyofluid) metabolit ve protein korona için ve ikincisi plazma metabolome karakterizasyonu için olmak üzere 1 mL aliquots'a bölün.</li>
	<li>bir termokserde 500 rpm'de hafifçe karıştırırken, insan plazmasında 1 mg/mL NM'yi 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın. Kuluçka santrifüjü takiben, NM'leri peletmek için numuneyi 4 °C'de 15 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüj edin.</li>
	<li>Metabolit korona analizi için plazma süpernatantını toplayın. Protein korona karakterizasyonu için NM-protein korona kompleksini koruyun.</li>
</ol>4. Protein korona izolasyonu
<ol><li>İlişkisiz proteinleri çıkarmak için NM-protein kompleksini (pelet) 1 mL 10x PBS Tampon ve girdapta 2 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde yeniden depolar. NM'leri peletmek için PBS çözeltisini 4 °C'de 15 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüj edin ve peleti bozmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>İlişkisiz proteinleri ve istenmeyen tuzları çıkarmak için peletin 1 mL amonyum bikarbonat tamponunda (ABC) (100 mM, pH 8.0) ve girdapta 2 dakika boyunca kuvvetlice yeniden depolayın. NM'leri peletmek için 4 °C'de 15 dakika boyunca 4.000 x g'da santrifüj; üstnatant kaldırmak ve atmak. Bu adımı yineleyin.</li>
	<li>NM-protein peletini 10 mM dithiotheritol içeren 20 μL ABC tamponunda (100 mM pH 8) eriterek protein disülfid bağlarını azaltın. Azaltma çözeltisini 56 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Proteinleri sindirmek için, %0,1 yüzey aktif madde içeren 20 μL ABC'ye 2 μg dizileme sınıfı Trypsin ekleyin. Sindirme çözeltisini 37 °C'de 16 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>100 mM ABC'de 55 mM'de 20 μL iodoasetamid ilavesi ile numuneyi alkylate edin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Yüzey aktif maddeyi ayırmak için 20 μL 0,1 M HCl ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.</li>
	<li>C18 paketlenmiş tuzdan arındırma pipet ucu kullanarak peptitleri zenginleştirin ve tuzdan arındıryın.<ol>
<li>Ucu 80 μL% 0.1 formik asit% 50 asetonitril ile 5 kez ıslatın, 80 μL% 0.1 formik asit ile 5 kez temizleyin, numuneyi 10 kez çekin ve elüte edin, 80 μL 0.1% formik asidi 5 kez yıkayarak numuneyi tuzdan arındırın ve numuneyi 80 μL% 0.1 formik asit% 70 asetonitül ile temiz bir düşük bağlayıcı PCR tüpüne 2 kez boşaltın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Numuneleri liyofilize edin ve analize kadar -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>5. Metabolit korona izolasyonu
<ol><li>Adım 3.3'ten NM plazma inkübasyonundan kontrol plazmasını ve süpernatantı alın ve numune hazırlama sırasında buzda tutun.</li>
	<li>Her birinden 50 μL'yi ayrı şişelere alın ve 10'da 1'ini DI suyuyla seyreltin. Seyreltilmiş her numuneden 50 μL alın ve adım 5.3 için yeni şişelere geçin.</li>
	<li>2 dakika boyunca 200 μL kloroform, 250 μL metanol ve 350 μL DI su ve kuvvetli girdap karışımı ekleyin. 4 °C'de 20.800 x g'da 10 dakika santrifüj.</li>
	<li>500 μL süpernatant alın ve 4 °C'de 10.000 x g'da 2 saat boyunca 3 kDa santrifüj filtreden filtreleyin. 430 μL ultrafiltrat alın ve bir hız vac kuru. Numuneler artık analizden önce dondurulabilir.</li>
</ol>6. CESI-MS sisteminin hazırlanması38
NOT: Kılcal damarların montajından önce, kılcal damarların giriş ve çıkış ucunun sağlam olup olmadığını ve kılcal damarda görünür kırılma olmadığını kontrol edin.
<ol><li>Protein korona analizi için nötr kaplamalı kılcal damarların montajı39.<ol>
<li>Cesi cihazına üretici yönergelerine uygun olarak yeni bir nötr kaplamalı kılcal damar (30 μm iç çapı ile 90 cm uzunluğunda) yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proteomik analiz için CESI kılcal damarlarının hazırlanması.<ol>
<li>Ayırma kılcal damarını 100 psi'de 5 dakika boyunca 100 mM HCl kullanarak ileri yönde yıkayın ve kılcal damarın çıkışında damlacık oluşumunu kontrol edin. Ayırma kılcal damarını 10 dakika boyunca 100 psi'de BGE ve ardından 30 dakika boyunca 100 psi'de DI suyu ile yıkayın (bu sadece yeni kılcal damarlar için gereklidir).</li>
		<li>Hem ayırma kılcal damarını hem de iletken kılcal damarı 5 dakika boyunca 90 psi'de BGE ile yıkayın ve her iki kılcal damarın çıkış ucunda damlacıklar oluşmasını sağlayın.</li>
		<li>Ayırma kılcal damarını 10 dakika boyunca 90 psi'de DI suyla yıkayın, ardından 0.1 M HCl ile 10 dakika boyunca 50 psi, ardından 10 dakika boyunca DI su ile 90 psi ve son olarak 10 dakika boyunca 90 psi'de BGE. CESI'yi daha önce açıklandığı gibi bir nanospray kaynağı ve adaptörü kullanarak MS'e ikiyekatla 38.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Metabolit korona karakterizasyonu için çıplak kaynaşmış silika kılcal damarların montajı38.<ol>
<li>Cesi cihazına üretici yönergelerine uygun olarak yeni bir çıplak kaynaşmış silika kılcal damar (30 μm iç çapa sahip 90 cm uzunluğunda) yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Metabolomik analiz için CESI kılcal damarlarının hazırlanması.<ol>
<li>Ayırma kılcal damarını 15 dakika boyunca 50 psi'de %100 MeOH kullanarak ileri yönde yıkayın ve kılcal damarın çıkışında damlacık oluşumunu kontrol edin. Hem ayırma kılcal damarını hem de iletken kılcal damarı 5 dakika boyunca 90 psi'de BGE ile yıkayın ve her iki kılcal damarın çıkışında damlacıkların oluşmasını sağlayın.</li>
		<li>Ayırma kılcal damarını 10 dakika boyunca 90 psi'de DI suyla, ardından 0.1 M NaOH ile 10 dakika boyunca 50 psi ile yıkayın, ardından 10 dakika boyunca DI su ile 90 psi ve son olarak 10 dakika boyunca 90 psi'de BGE. CESI'yi daha önce açıklandığı gibi bir nanospray kaynağı ve adaptörü kullanarak ESI-MS'e bir çift. 38
</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Protein korona analizi için CE-MS
<ol><li>50 mM amonyum asetat pH 4.0'ın 20 μL'sinde 4.8 adımından örnekleri yeniden biriktirin.</li>
	<li>Numunenin 5 psi 10 s hidrodinamik enjeksiyonu gerçekleştirin. Aşağıdaki basınç gradyanıyla 30 kV ayırma voltajı kullanarak ayırın: 1 psi'de 0-10 dk, 1,5 psi'de 10-35 dk ve 100 mM kullanarak 5 psi'de 35-45 dk, BGE olarak pH 2.9 asetik asit.</li>
	<li>250-2000 m/z arasındaki kütle spektrumlarını toplayın ve en iyi 10 veriye bağımlı parçalanma alımı.</li>
	<li>Numuneler arasında, 100 psi'de 3 dakika ve ayırma kılcal damarı için 10 dakika 100 psi BGE ve iletken sıvı kılcal damar için 100 psi'de 3 dakika boyunca 0,1 M HCl ile kılcal damarları durulayın.</li>
</ol>8. Metabolit korona analizi için CESI-MS
NOT: Tüm numuneler, katyonların tespiti için pozitif modda ve bir kez de sonyonların tespiti için negatif modda olmak üzere iki kez analiz edilmelidir. Kontrol plazma örneklerinin en az 5 kez analiz edilmesi gerekir.
<ol><li>430 μL DI su ve 2 dakika boyunca güçlü bir girdapta 5.4 adımından NM maruz kalan ve pozlanmamış plazma örneklerini yeniden depolayın. 0,1 μm membran filtresinden filtreleyin.</li>
	<li>95 μL filtrat alın ve katyonlar için 200 μM'de 5 μL iç standart (L-methionine sülfin) ve anionlar için 400 μM (2,2,4,4-D4-sitrik asit) ve girdabı kuvvetlice ekleyin. CESI-MS analizi öncesinde 10 dakika boyunca 4 °C'de 4.000 x g'da santrifüj.</li>
	<li>Numuneyi 2 psi'de 30 s (katyon) ve 40 s (anion) için hidrodinamik olarak enjekte edin.</li>
	<li>Metabolitleri ileri (cations) ve ters (anionlar) modda 30 kV ayırma voltajı ile% 10 asetik asitte ayırın. Ters ayırma modu, ayırma kılcal damarı üzerinde 0,5 psi ileri basınç ile desteklenir.</li>
	<li>Kütle aralığı 65-1000 m/z üzerinde pozitif (cations) veya negatif (anionlar) modda veri toplamak için kütle spektrometresini ayarlayın. Numuneler arasında, 0,1 M HCl, 0,1 M NaOH, DI su ve BGE ile kılcal damarları 2 dakika boyunca 50 psi'de durulayın.</li>
</ol>

J.A.T, ACEnano projesine endüstri ortağı olarak katılan AB Sciex UK Ltd'nin bir çalışanıdır, J.A.T ve diğer tüm yazarların bu çalışmada çıkar çatışması yoktur.

Bu, CESI-MS kullanarak aynı örnekten proteinleri ve metabolitleri içeren tam biyomoleküler koronayı karakterize etmek için önerilen ilk yöntemdir. Aynı örnekten hem proteinleri hem de metabolitleri karakterize etme yeteneği, korona oluşum sürecine ve NANOMEDIKİNLER olarak NMs toksisitesi ve etkinliği için etkilerine ilişkin yeni içgörüler sağlayan tek bir deneysel maruziyetten toplanan veri miktarını önemli ölçüde artıracaktır. Ayrıca, CESI-MS, her iki biyomolekül sınıfını da sadece kılcal damar değişikliği ile karakterize etmek için ideal bir platformdur. İleriye doğru, sulu olmayan CE için geliştirilen yeni yöntemler lipidomiklerin CE-MS40 kullanılarak gerçekleştirilmesini sağlayacaktır, böylece proteinleri, metabolitleri ve lipitleri tek bir platform kullanarak analiz etmek artık mümkündür. Mevcut konvansiyonel yaklaşımlar, biri protein koronası ve diğeri metabolit korona için olmak üzere iki özel LC-MS platformu gerektirecektir. Böylece, bu yaklaşım tek bir analitik platform kullanarak iki kat daha fazla veri toplayabilir.
Bu protokol koronanın dolaylı olarak ölçülmeyi önerdiğinden, özellikle metabolit korona ile ilgili bu yaklaşımda bazı uyarılar vardır. Bu nedenle, metabolit seviyeleri NM'lere göre yüksek konsantrasyonlarda mevcut olduğunda ve matriste metabolit konsantrasyonundaki sonraki düşüş küçük olduğunda sorun ortaya çıkabilir. Bununla birlikte, protein koronasının aksine, her NM'nin benzersiz yüzey kimyalarına sahip olması nedeniyle metabolit koronayı izole etmek için "herkese uyan bir boyut" yaklaşımının geliştirilmesi olası değildir. İleride, metabolit koronayı izole etmek için NM'ye özgü yaklaşımların geliştirilmesi ve doğrulanmış olması daha olasıdır; bu yalnızca belirli bir NM için geçerli olacaktır. Buna rağmen, CESI-MS, polar yüklü metabolitlerin nasıl izole edildiklerine bakılmaksızın karakterizasyonu için hala son derece uygun bir platform olacaktır. Ayrıca dikkat çekici olan, NM'leri peletmek için tasarlanmış santrifüjleme adımları sırasında bir pelet oluşmazsa, daha yüksek bir santrifüj kuvveti gerekebilir; bu büyük olasılıkla daha az yoğun NM'lerde ortaya çıkar. Kılcal damarların dar deliği nedeniyle tüm filtreleme adımlarına protokol içinde uyulması da önemlidir, herhangi bir partikül madde numuneden yeterince ortadan kaldırılmamışsa bunlar kolayca engellenebilir.
Protein korona birkaç yıldır yoğun bir araştırma alanı olsa da, bunu metabolit korona ile birleştirme yeteneği, biyo-nano arayüz6,14'ü araştıran bilim adamları için yeni bir ilgi alanıdır. Bugüne kadar, bu çalışmaların çoğunluğu metabolit korona9,28'inpolar olmayan lipid fraksiyonu üzerinde yoğunlaşmıştır. Bu akım yöntemi, enerji metabolizması, glikoliz ve DNA sentezinde yer alan önemli metabolitleri içeren koronadaki yüksek polar ve yüklü metabolitlerin karakterize edilmesine olanak tanır. Sonuç olarak, proteomik iş akışı ile birleştirildiğinde, biyomoleküler koronanın daha bütünsel bir karakterizasyonu mümkündür. Bu, ilerleyen biyo-nano etkileşimlerin daha derinlemesine analizini sağlar. Bu yöntem, protein ve metabolit etkileşimleri yoluyla reseptör aracılı endositoz hakkında gelişmiş mekanistik içgörüler sağlar. Ayrıca proteinler ve küçük moleküller arasındaki korona içi ve intra etkileşimler araştırılabilir; örneğin, son zamanlarda koronadaki proteinlerin metabolitlerin işe alınmasında kilit bir rol oynadığı gösterilmiştir15. Şekil 3 ve Şekil 4'teki temsili sonuçların metabolitlerin mutlak nicelemesi olduğunu belirtmek gerekir, ancak, maruz kalan plazmaya kıyasla kontrollerdeki tüm CE-MS özelliklerini karşılaştırmak için çok değişkenli veri analizi kullanan hedefsiz bir yaklaşım metabolit bağlamayı da aydınlatacak olacaktır. Bu nedenle, metabolitlerin ve proteinlerin NM koronalarına nasıl ve hangi işe alımlarını etkilediğini araştırmak için önemli bir kapsam vardır. Bu ek çalışmalar, nanotıpların teslimatını optimize etmek veya biyomoleküler korona engelleme veya hedefleme işlevlerini maskeleme nedeniyle farmasötik eylemin bastırılması gibi gelişimlerinin önündeki engelleri ortaya çıkarmak için koronaların tasarlanmasına yardımcı olabilir.
CESI-MS, yaklaşık 20 nL/dk'lik nano ölçekli akış hızları ve organik çözücülerin minimum kullanımı ile, sırasıyla metabolomik ve proteomik çalışmalar için temel zorluklar olan solvent kullanımı açısından standart LC-MS ve nanoLC-MS'e göre yeşil ve ekonomik kimlik bilgilerinde bir iyileşme sunmaktadır. CESI-MS, LC-MS tabanlı yöntemler11,15ile olumlu bir şekilde karşılaştıran hem geçiş süresi hem de pik alan için oldukça tekrarlanabilir sonuçlar sunar. Ayrıca, nanoLC-MS ile karşılaştırıldığında, taşıma CESI-MS'te bir sorun değildir. Bu nedenle, numune analizleri arasında kapsamlı sistem temizliği gerekli değildir, bu da numune verimini büyük ölçüde artırır11.
Özetle, önerilen iş akışı, NM'lerin tam biyomoleküler koronasının hem protein hem de metabolit bileşenlerini karakterize etmek için bir yaklaşımı detaylandıran ilk iş akışıdır. Bu, biyo-nano etkileşimlerin yeni bir yönünün kilidini açar, metabolit korona, böylece aynı örnekten iki kat daha fazla verinin toplanmasını sağlayarak biyo-nano arayüzdeki etkileşimlerin daha eksiksiz anlaşılmasını sağlar.

Biyo-nano etkileşimler, nanomalzeme (NM) yüzeyleri ile biyomoleküllerin adsorb'dan NM'ye kadar olduğu biyolojik matrisler arasındaki arayüzde, nanogüvenlik ve nanotıp1'idestekleyen yoğun bir araştırma alanıdır. Adsorbe edilmiş biyomoleküllerin bu katmanı NM'lere biyolojik bir kimlik verir, böylece hücreler onları "benlik" olarak tanımlar, daha sonra hücresel alım, dağılım ve biyolojik uç noktaları2,3,4' ü etkilemez. Biyo-nano çalışmaların büyük çoğunluğu korona içindeki proteinlere odaklanmıştır ve proteinlerin farklı bileşimlerdeki NM'ler arasında nicel ve niteliksel olarak değiştiğini göstermiştir5. Bu varyasyon, kompozisyon ve tuz içeriği de dahil olmak üzere biyolojik matrisin özelliklerine ek olarak boyut, işlevselleştirme ve malzeme gibi NM'nin özelliklerine bağlıdır5. Biyo-nano arayüzde yükselen bir ilgi alanı, NMs6'yaadsorb yapan metabolitlerdir. Çeşitli çalışmalar, proteinlerde olduğu gibi, NM özelliklerinin koronadaki metabolitlerin bileşimini belirlemede önemli bir faktör olduğunu ve NM maruziyetinin biyolojik sonuçlarını etkileyebileceğini göstermiştir6,7,8.
Biyomoleküler korona çalışmalarında, karakterizasyonu, korona oluşumu, korona içindeki biyomoleküllerin izolasyonu, nitel veya nicel kütle spektrometresi ile tespiti ve tanımlanması için dört farklı aşama vardır9. Bugüne kadar, SDS-PAGE çalışan tamponda kaynatma, çözücü ve tuz ekstraksiyonları veya NM'lerin yüzeyinde in situ proteinlerin doğrudan sindirimi de dahil olmak üzere protein koronasını izole etmek için bir dizi teknik benimsenmiştir. Koronadaki metabolitler açısından, izolasyon çözücüler kullanılarak çeşitli yöntemlerle daha karmaşıktır ve hatta çözelti olarak önerilen NM'lerin çözünmesi8,10,11. Bununla birlikte, protein koronasının aksine, metabolom tarafından işgal edilen geniş kimyasal alan ve olası NM'lerin çeşitliliği nedeniyle, NM'lerden metabolitlerin izolasyonu için "herkese uyan bir boyut" yaklaşımının uygulanması olası değildir. Alternatif bir yaklaşım, NM maruziyeti öncesi ve sonrası biyolojik matrisi, metabolitlerin NM'lere adsorpsiyonuna atfedilen metabolit konsantrasyonlarındaki farkla karakterize etmektir.
Bu alternatif yaklaşım tüm biyofluidler ve NM'ler için geçerli olacaktır ve iki kat daha fazla analiz gerektirmesine rağmen, sonuç olarak metabolit koronanın çok daha kesin bir ölçüsünü sunar ve NM yüzeyinden düşük metabolit geri kazanımlarının spesifik metabolitin düşük bağlanmasıyla karıştırılma riski yoktur.
Biyomoleküler korona analizinin ikinci adımı biyomoleküllerin tespitidir. Geleneksel olarak koronadaki proteinler için, bu proteomiğin çalışma atı olan nano-LC-MS'in havalesi olmuştur; NMR13 , 1Dve 2D SDS-PAGE gibi diğer yaklaşımlar da uygulanmıştır. Metabolit korona LC-MS7,GC-MS8 ve doğrudan infüzyon kütle spektrometresi açısından14. Bununla birlikte, son zamanlarda yeni bir yaklaşım çekiş kazanmaya başladı, yani kılcal elektroforez-kütle spektrometresi (CE-MS)11,15 ve NM laboratuvarlarında NM'lerin çeşitli fiziksel ve kimyasal özelliklerini karakterize etmek için bağımsız bir teknik olarakmevcuttur 16. CE-MS nanoLC-MS ve GC-MS için bir ortogonal ayırma tekniğidir ve yüksek polar ve yüklü metabolitlerin17,18algılanmasını sağlayabilir. Ayrıca, CE-MS proteinlerin analizi ve fosforilasyon ve glikosilasyon 19 , 20 ,21,22gibi posttranslational modifikasyonları için çokuygundur. Son adım, tanımlama ve veri analizi, nicel / nitel veya hedefli / hedefsiz bir yaklaşımın kullanılıp kullanılmadığına bağlı olarak çeşitli şekillerde gerçekleştirilebilir, ancak bu, bu protokolün havalesinin dışında kalır.
CE ve nanoESI arayüzünün bir kombinasyonu olan CESI-MS, kılımsız bir arayüz kullanan CE teknolojisinde yeni bir gelişmedir. Bu, ultra düşük akışlı CE'nin (<20 nL/ dk) seyreltme olmadan yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometresine doğrudan bağlanmasına olanak tanır, bu da algılama hassasiyetinin önemli ölçüde iyileştirilmesine neden olur23,24,25. CESI-MS, hacim sınırlı numunelerin (< 10 μL) analizini sağlarken son derece hassas bir analizsağlar 26. CESI-MS ayrıca, tekrarlanabilirlik açısından proteomik ve metabolomiklerde kullanılan geleneksel düşük akış hızı nanoLC-MS yaklaşımları ile olumlu bir şekilde karşılaştırır27,28, aktarım hızı ve tam biyomoleküler korona karakterizasyonu için heyecan verici bir umut haline getirir.
CESI-MS'in biyo-nano etkileşimlerin analizleri için potansiyelini vurgulamak için bu çalışma, NM biyomoleküler koronayı tek bir insan plazma örneğinden izole etmek için gereken numune hazırlığını, tam biyomoleküler NM koronanın hem protein hem de metabolit yönlerinden verileri en üst düzeye çıkaracak şekilde açıklar. İnsan plazmasının kullanımı hakkında rapor verirken, bu protokol kan serumu, tam hücre kültürü ortamı, hücre lisat, beyin omurilik sıvısı veya idrar gibi diğer biyofelidler için eşit derecede uygun olacaktır. Bu iki bileşenin (proteinler ve metabolitler) analizleri daha sonra protein korona için nötr kaplı CESI kılcal damarları ve hem katyonik hem de aniyonik metabolitler için çıplak kaynaşmış silika kılcal damarlar kullanılarak tanımlanacaktır.

<table><tbody><tr><td>1,4-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2,2,4,4-D4-citric</td><td>Simga</td><td>485438-1G</td><td>Internal standard anion</td></tr><tr><td>Ammonium Acetate &gt;98%</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Bicarbonate &gt;99.5%</td><td>Sigma</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Capillary cartridge coolant</td><td>Sciex</td><td>359976</td><td></td></tr><tr><td>CESI 8000 instrument</td><td>Sciex</td><td>A98089</td><td></td></tr><tr><td>CESI Cap</td><td>Sciex</td><td>B24699</td><td></td></tr><tr><td>CESI Vials</td><td>Sciex</td><td>B11648</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>650498</td><td>Toxic, use in a fume hood</td></tr><tr><td>Glacial Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid 1mol/L</td><td>Sigma</td><td>43617</td><td></td></tr><tr><td>Iosoacetamide</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>L-methionine sulfone</td><td>Sigma</td><td>M0876-1G</td><td>Internal standard cation</td></tr><tr><td>Methonal (LC-MS Ultra Chromasolve)</td><td>Sigma</td><td>14262</td><td>Use in a fume hood</td></tr><tr><td>Microvials</td><td>Sciex</td><td>144709</td><td></td></tr><tr><td>nanoVials</td><td>Sciex</td><td>5043467</td><td></td></tr><tr><td>Neutral Surface Cartridge 30 &amp;micro;M ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07368</td><td></td></tr><tr><td>OptiMS Adapter for Sciex Nanospray III source</td><td>Sciex</td><td>B07363</td><td>B07366 and B83386 for Thermo mass spectrometers, B85397 for Waters mass spectrometers, B86099 for Bruker mass spectrometers</td></tr><tr><td>OptiMS Fused-Silica Cartridge 30 &amp;micro;m ID x 90 cm total length</td><td>Sciex</td><td>B07367</td><td></td></tr><tr><td>Phospahte buffered saline 10x</td><td>Sigma</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>Pierce C18 Tips, 100 &amp;micro;L bed</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>87784</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>876</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 100 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>16688</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrene carboxylated 1000 nm</td><td>Polysciences Inc</td><td>08226</td><td></td></tr><tr><td>Rapigest SF (surfactant)</td><td>Waters</td><td>186001860</td><td></td></tr><tr><td>Sequencing Grade modified Trypsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>SiO2 Ludox TM-40</td><td>Sigma</td><td>420786</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide solution</td><td>Simga</td><td>72079</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 Dispex coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 PVP coated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr><tr><td>TiO2 uncoated</td><td>Promethion particles</td><td>Bespoke particles</td><td></td></tr></tbody></table>

capillary electrophoresis mass spectrometry approaches for characterization of the protein and metabolite corona acquired by nanomaterials

Koronayı oluşturmak için biyomoleküllerin çevredeki biyolojik matrislerden nanomalzemelerin (NM) yüzeyine adsorpsiyonu son on yıldır ilgi görüyor. Biyo-nano arayüze olan ilgi, biyomoleküler koronanın NM'lere biyolojik bir kimlik vermesi ve böylece vücudun onları "benlik" olarak tanımlamasına neden olmasından kaynaklanmaktadır. Örneğin, önceki çalışmalar, koronadaki proteinlerin hücresel alımı etkilemek için membran reseptörleriyle etkileşime girebildiğini göstermiştir ve koronanın NM'lerin hücresel kaçakçılığından ve nihai toksisitelerinden sorumlu olduğunu ortaya koymuştur. Bugüne kadar, çoğu araştırma protein koronasına odaklandı ve koronaya dahil edilen metabolitlerin olası etkilerini veya tam biyomoleküler koronadaki bileşenler arasındaki sinerjik etkileri göz ardı etti. Bu nedenle, bu çalışma, biyomoleküler koronanın hem protein hem de metabolit bileşenlerini paralel olarak aşağıdan yukarıya proteomik ve metabolomik yaklaşımlar kullanarak karakterize etmek için metodolojileri göstermektedir. Bu, protein iyileşmesini artırmak için kullanılan bir yüzey aktif madde ile protein koronasının parçacık üzerinde sindirilmesini ve NM maruziyetlerinden önce ve sonra metabolit matrislerini analiz ederek metabolit koronanın pasif bir şekilde karakterizeini içerir. Bu çalışma, NM korona karakterizasyonu için yeni bir teknik olarak kılcal elektroforez - kütle spektrometresi (CESI-MS) tanıtmaktadır. Burada özetlenen protokoller, CESI-MS'in NM'ler tarafından elde edilen hem protein hem de metabolit koronanın güvenilir bir şekilde karakterizasyonu için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. CESI-MS'e taşınma, gerekli numune hacmini (geleneksel sıvı kromatografisine kıyasla - kütle spektrometresi (LC-MS) yaklaşımlarına kıyasla) 5 μL'ye kadar numuneden mümkün olan çoklu enjeksiyonlarla büyük ölçüde azaltır ve hacim sınırlı numuneler için idealdir. Ayrıca, CESI-MS'teki düşük akış hızları (<20 nL/dk) ve organik çözücü ihtiyacını ortadan kaldıran sulu elektrolit kullanımı nedeniyle analizin çevresel sonuçları LC-MS açısından azaltılmıştır.

Açıklanan yöntem, aynı insan plazma örneğini kullanarak NM biyomoleküler koronadaki proteinleri ve metabolitleri karakterize eden ilk yöntemdir. Bu yöntem, >200 proteinleri ve >150 metabolitleri tespit edebilir, böylece tam biyomoleküler koronanın en kapsamlı genel görünümünün belirlenmesini sağlayarak NM hücresel bağlanma, alım ve etkilerin daha iyi anlaşılmasını sağlar.
CESI-MS'in hem proteomik (Şekil 1) hem de metabolomik (Şekil 2) ayırma ve algılama için kullanılması, her yaklaşım için her iki kılcal damarda da iyi ayırma pencereleri göstermektedir.
Bu yöntem, çok çeşitli NMs bileşimlerinde koronadaki proteinleri ayırt edebilir, böylece yöntemlerin çok çeşitli fiziksel ve kimyasal özelliklerde NM'lere uygulanabilirliğini gösterir (Tablo 1).
Metabolit koronanın benzersiz parmak izleri de bu metodolojinin metabolomik dalı kullanılarak ayırt edilebilir (Şekil 3). Bu yaklaşım NM metabolit koronayı karakterize etmek için pasif bir yaklaşım kullansa da, izomerlerin diferansiyel adsorpsiyonu gibi biyomoleküler koronada metabolitlerin rolüne dair ilginç içgörüler ortaya çıkarabilir (Şekil 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig01.jpg"> Şekil 1: Parçacık üzerinde bir sindirimi takiben CESI-MS kullanılarak bir SiO2 protein korona ayrımının örnek elektroferogramı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig02.jpg"> Şekil 2: Plazmadaki endojen bileşiklerden CE-MS tarafından elde edilen ayıklanmış iyon elektroferogramları örneği. Numaralı bileşikler şunlardır: 1. Ornitin; 2. Lizin; 3. Arginin; 4. Histidin; 5. Kreatin; 6. Glicin; 7. Alanine; 8. Valine; 9. Izolösin; 10. Lösin; 11. Serine; 12. Threonine; 13. Kuşkonmaz; 14. Methionine; 15. Glutamin; 16. Glutamik asit; 17. Fenil-D5-alanin; 18. Fenilalanin; 19. Tırozin; 20. Proline; 21. Methionine sülfiton (iç standart). Açık erişimli Creative Commons CC BY lisansı altında yayınlandı ve Zhang veark. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: 6 NMs dizisinde protein korona analizi. Silika (SiO2),titania (TiO2),PVP kapaklı titania (TiO2-PVP), dispex capped titania (TiO2-Dispex), polistiren ve karboksillenmiş polistiren NM'lerde tanımlanan protein sınıflarının ısı haritası. Yüzdeler, proteinlerin her protein için en iyi 3 peptit bolluğuna dayanan toplam protein içeriğine göre bolluğunu ifade eder. Farklı NM koronalarındaki proteinlerin göreceli bolluklarında gözlenen farklılıklar göz önüne alındığında, bu önerilen protokolün farklı NM'lerin protein koronası arasında ayrım yapmak için yeterince hassas olduğu açıktır. Açık erişimli Creative Commons CC BY lisansı altında yayınlanan protein koronasının CESI-MS analizinden çoğaltılan şekil11. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61760/Table_1.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig03.jpg"> Şekil 3: NM koronasında katyonik metabolitlerin hedefli analizi. SiO2 ve TiO2 NM'lere yapılan atıfların adsorpsiyonu. Kırmızı, metabolitlerin ilk konsantrasyonunu ifade ederken, mavi 37 °C'de NM'lerle 1 saat inkübasyonu takiben metabolitlerin konsantrasyonunu ifade eder. Çözeltideki metabolit konsantrasyonundaki azalma, NM yüzeyine metabolit adsorpsiyonunun bir sonucudur. Polistiren NM'ler için metabolitlerin önemli bir adsorpsiyonunun gözlenmedi. Açık erişimli Creative Commons CC BY lisansı altında yayınlanan metabolit koronanın CESI-MS hedefli analizinden elde edilen şekil15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61760/61760fig04.jpg"> Şekil 4: NM koronadaki anionik metabolitlerin izomer adsorpsiyonu odaklı hedefli analizi. Bir dizi titania NM'ye anionların adsorpsiyonlanması, şeker fosfatları gibi çeşitli izomerler arasında açık farklar olduğunu göstermektedir. Kırmızı, metabolitlerin ilk konsantrasyonunu ifade ederken, mavi 37 °C'de NM ile 1 saat inkübasyonu takiben metabolitlerin konsantrasyonunu ifade eder. Çözeltideki metabolit konsantrasyonundaki azalma, NM yüzeyine metabolit adsorpsiyonunun bir sonucudur. SiO2 için metabolitlerin önemli bir adsorpsiyonunun gözlenmedi ve polistiren NM'ler. Kutu çizimleri minimum ve maksimum değerleri, ortanca ve interquartile aralıklarını temsil eder. Açık erişimli Creative Common CC BY lisansı altında yayınlanan metabolit koronanın CESI-MS hedefli analizinden çoğaltılan şekil15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61760/61760fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Analit</td>
			<td>Ortalama RSD tepe alanı</td>
			<td>Ortalama RSD geçiş süresi</td>
		</tr>
<tr>
<td>1928 peptitler gün içi (n=3)</td>
			<td>15%</td>
			<td>0.30%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gün içinde 27 gösterim (n=16)</td>
			<td>5.80%</td>
			<td>2.20%</td>
		</tr>
<tr>
<td>27 gün içi katyon (n=36)</td>
			<td>8.60%</td>
			<td>1.80%</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Peptitler ve katyonik metabolitler için CESI-MS teknik kopyalarının tekrarlanabilirliği. RSD: tekrarlanabilirlik ölçüsü olarak göreli standart sapma. CESI-MS'in yoğun alanlar ve geçiş süreleri açısından tekrarlanabilirliği çok iyidir, tüm analizler ortalama RSD'ye <15% ve göç süreleri% 2.2 < sahiptir. Bu sonuçlar, bu teknik kullanılarak toplanan verilere atfedilebilecek yüksek güven derecesini gösterir ve tespit edilen varyasyonların analitik varyasyon yerine örnek bileşimindeki (NM'lerde zenginleştirme) gerçek farklılıklardan kaynaklandığını doğrular. Tablo 2, daha önce11,15olarak sunulan sonuçlardan oluşturulur.

Watch this Scientific Journal Video about Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials at JoVE.com

Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Burada, kılcal elektroforez kullanılarak biyokütlelerden nanomalzemeler tarafından elde edilen tam biyomoleküler korona, proteinler ve metabolitleri karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz - kütle spektrometresi yaklaşımı.

Nanomalzemeler Tarafından Elde Edilen Protein ve Metabolit Koronanın Karakterizasyonu için Kılcal Elektroforez Kütle Spektrometresi Yaklaşımları

The adsorption of biomolecules from surrounding biological matrices to the surface of nanomaterials (NMs) to form the corona has been of interest for the ...

capillary-electrophoresis-mass-spectrometry-approaches-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

4.4K Görüntüleme.  University of Birmingham. Burada, kılcal elektroforez kullanılarak biyokütlelerden nanomalzemeler tarafından elde edilen tam biyomoleküler korona, proteinler ve metabolitleri karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz - kütle spektrometresi yaklaşımı.

Video: Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry Approaches for Characterization of the Protein and Metabolite Corona Acquired by Nanomaterials

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a protocol is presented for the analysis of anionic and cationic metabolites in biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry (CE-MS). CE is well-suited for the analysis of highly polar and charged metabolites as compounds are separated on the basis of their charge-to-size ratio. A recently developed sheathless interfacing design, i.e., a porous tip interface, is used for coupling CE to electrospray ionization (ESI) MS. This interfacing approach allows the effective use of the intrinsically low-flow property of CE in combination with MS, resulting in nanomolar detection limits for a broad range of polar metabolite classes. The protocol presented here is based on employing a bare fused-silica capillary with a porous tip emitter at low-pH separation conditions for the analysis of a broad array of metabolite classes in biological samples. It is demonstrated that the same sheathless CE-MS method can be used for the profiling of cationic metabolites, including amino acids, nucleosides and small peptides, or anionic metabolites, including sugar phosphates, nucleotides and organic acids, by only switching the MS detection and separation voltage polarity. Highly information-rich metabolic profiles in various biological samples, such as urine, cerebrospinal fluid and extracts of the glioblastoma cell line, can be obtained by this protocol in less than 1 hr of CE-MS analysis.

A protocol for metabolic profiling of biological samples by capillary electrophoresis&#8211;mass spectrometry using a sheathless porous tip interface design is presented.

Biyolojik Numune metabolik profil için Sheathless Kapiler Elektroforez-Kütle Spektrometre

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Biyokimya

Extraction of Aqueous Metabolites from Cultured Adherent Cells for Metabolomic Analysis by Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but also to identify biomarkers for early-stage cancer detection and prediction of chemotherapy response in cancer patients. Preparation of uniform samples for metabolomic analysis is a critical issue that remains to be addressed. Here, we present an easy and reliable protocol for extracting aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis using capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS). Aqueous metabolites from cultured cells are analyzed by culturing and washing cells, treating cells with methanol, extracting metabolites, and removing proteins and macromolecules with spin columns for CE-MS analysis. Representative results using lung cancer cell lines treated with diamide, an oxidative reagent, illustrate the clearly observable metabolic shift of cells under oxidative stress. This article would be especially valuable to students and investigators involved in metabolomics research, who are new to harvesting metabolites from cell lines for analysis by CE-MS.

The purpose of this article is to describe a protocol for extraction of aqueous metabolites from cultured adherent cells for metabolomic analysis, particularly, capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Kılcal Elektroforez-kütle spektrometresi tarafından metabolomik analiz için kültürlü yapışan hücrelerden sulu metabolitlerin çıkarılması

Metabolomic analysis is a promising omics approach to not only understand the specific metabolic regulation in cancer cells compared to normal cells but ...

Kanser Araştırmaları

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

Boyutlar-dışlama kromatografi ile çok açılı ışık saçılmasına bağlı proteinlerin karakterizasyonu (SEC-,)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down proteomics that aims to characterize proteoforms in complex proteomes. However, the application of CZE-MS/MS for large-scale top-down proteomics has been impeded by the low sample-loading capacity and narrow separation window of CZE. Here, a protocol is described using CZE-MS/MS with a microliter-scale sample-loading volume and a 90-min separation window for large-scale top-down proteomics. The CZE-MS/MS platform is based on a linear polyacrylamide (LPA)-coated separation capillary with extremely low electroosmotic flow, a dynamic pH-junction-based online sample concentration method with a high efficiency for protein stacking, an electro-kinetically pumped sheath flow CE-MS interface with extremely high sensitivity, and an ion trap mass spectrometer with high mass resolution and scan speed. The platform can be used for the high-resolution characterization of simple intact protein samples and the large-scale characterization of proteoforms in various complex proteomes. As an example, a highly efficient separation of a standard protein mixture and a highly sensitive detection of many impurities using the platform is demonstrated. As another example, this platform can produce over 500 proteoform and 190 protein identifications from an Escherichia coli proteome in a single CZE-MS/MS run.

A detailed protocol is described for the separation, identification, and characterization of proteoforms in protein samples using capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). The protocol can be used for the high-resolution characterization of proteoforms in simple protein samples and the large-scale identification of proteoforms in complex proteome samples.

Büyük ölçekli tepeden proteomik kılcal bölge Elektroforez Tandem kütle spektrometresi kullanılarak

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

Kimya

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Yukarıdan Aşağıya Kütle Spektrometrisi ile Proteinlerin Konformasyonel Karakterizasyonu için Kapiler Elektroforez Bazlı Hidrojen/Döteryum Değişimi

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Biyoloji

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. The speed by which the ions traverse the drift region depends on their size: large ions will experience a greater number of collisions with the background inert gas (usually N2) and thus travel more slowly through the IM device than those ions that comprise a smaller cross-section. In general, the time it takes for the ions to migrate though the dense gas phase separates them, according to their collision cross-section (&Omega;). 
Recently, IM spectrometry was coupled with mass spectrometry and a traveling-wave (T-wave) Synapt ion mobility mass spectrometer (IM-MS) was released. Integrating mass spectrometry with ion mobility enables an extra dimension of sample separation and definition, yielding a three-dimensional spectrum (mass to charge, intensity, and drift time). This separation technique allows the spectral overlap to decrease, and enables resolution of heterogeneous complexes with very similar mass, or mass-to-charge ratios, but different drift times. Moreover, the drift time measurements provide an important layer of structural information, as &Omega; is related to the overall shape and topology of the ion. The correlation between the measured drift time values and &Omega; is calculated using a calibration curve generated from calibrant proteins with defined cross-sections1.
The power of the IM-MS approach lies in its ability to define the subunit packing and overall shape of protein assemblies at micromolar concentrations, and near-physiological conditions1. Several recent IM studies of both individual proteins2,3 and non-covalent protein complexes4-9, successfully demonstrated that protein quaternary structure is maintained in the gas phase, and highlighted the potential of this approach in the study of protein assemblies of unknown geometry. Here, we provide a detailed description of IMS-MS analysis of protein complexes using the Synapt (Quadrupole-Ion Mobility-Time-of-Flight) HDMS instrument (Waters Ltd; the only commercial IM-MS instrument currently available)10. We describe the basic optimization steps, the calibration of collision cross-sections, and methods for data processing and interpretation. The final step of the protocol discusses methods for calculating theoretical &Omega; values. Overall, the protocol does not attempt to cover every aspect of IM-MS characterization of protein assemblies; rather, its goal is to introduce the practical aspects of the method to new researchers in the field.

Ion mobility-mass spectrometry is an emerging gas-phase technology that separates ions, based on their collision cross-section and mass. The method provides three-dimensional information on the overall topology and shape of protein complexes. Here, we outline a basic procedure for instrument setting and optimization, calibration of drift times, and data interpretation.

T-dalgası İyon Hareketlilik-Kütle Spektrometresi: Protein Karmaşık Analiz Temel Deneysel Prosedürler

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry (CCMS)

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity chromatography 1 or Activity Based Protein Profiling 2. Trifunctional Capture Compounds (CCs, Figure 1A) 3 are the basis for a generic approach, in which the initial equilibrium-driven interaction between a small molecule probe (the selectivity function, here S-adenosyl-L-homocysteine, SAH, Figure 1A) and target proteins is irreversibly fixed upon photo-crosslinking between an independent photo-activable reactivity function (here a phenylazide) of the CC and the surface of the target proteins. The sorting function (here biotin) serves to isolate the CC - protein conjugates from complex biological mixtures with the help of a solid phase (here streptavidin magnetic beads). Two configurations of the experiments are possible: "off-bead" 4 or the presently described "on-bead" configuration (Figure 1B). The selectivity function may be virtually any small molecule of interest (substrates, inhibitors, drug molecules).
S-Adenosyl-L-methionine (SAM, Figure 1A) is probably, second to ATP, the most widely used cofactor in nature 5, 6. It is used as the major methyl group donor in all living organisms with the chemical reaction being catalyzed by SAM-dependent methyltransferases (MTases), which methylate DNA 7, RNA 8, proteins 9, or small molecules 10. Given the crucial role of methylation reactions in diverse physiological scenarios (gene regulation, epigenetics, metabolism), the profiling of MTases can be expected to become of similar importance in functional proteomics as the profiling of kinases. Analytical tools for their profiling, however, have not been available. We recently introduced a CC with SAH as selectivity group to fill this technological gap (Figure 1A).
SAH, the product of SAM after methyl transfer, is a known general MTase product inhibitor 11. For this reason and because the natural cofactor SAM is used by further enzymes transferring other parts of the cofactor or initiating radical reactions as well as because of its chemical instability 12, SAH is an ideal selectivity function for a CC to target MTases. Here, we report the utility of the SAH-CC and CCMS by profiling MTases and other SAH-binding proteins from the strain DH5&alpha; of Escherichia coli (E. coli), one of the best-characterized prokaryotes, which has served as the preferred model organism in countless biochemical, biological, and biotechnological studies. Photo-activated crosslinking enhances yield and sensitivity of the experiment, and the specificity can be readily tested for in competition experiments using an excess of free SAH.

Profiling of Methyltransferases and Other S-adenosyl-L-homocysteine-binding Proteins by Capture Compound Mass Spectrometry CCMS

Capture Compounds are trifunctional small molecules to reduce the complexity of the proteome by functional reversible small molecule-protein interaction followed by photo-crosslinking and purification. Here we use a Capture Compound with S-adenosyl-L-homocysteine-binding as selectivity function to isolate methyltransferases from an Escherichia coli whole cell lysate and identify them by MS.

Methyltransferases, profilleme ve Diğer S Adenosil- L</subYakalama Bileşik Kütle Spektrometresi (CCMS)> homosistein bağlayıcı Proteinler

There is a variety of approaches to reduce the complexity of the proteome on the basis of functional small molecule-protein interactions such as affinity ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in current research and a plethora of methods for their investigation is available1. Protein-protein interactions often are highly dynamic and may depend on subcellular localization, post-translational modifications and the local protein environment2. Therefore, they should be investigated in their natural environment, for which co-immunoprecipitation approaches are the method of choice3. Co-precipitated interaction partners are identified either by immunoblotting in a targeted approach, or by mass spectrometry (LC-MS/MS) in an untargeted way. The latter strategy often is adversely affected by a large number of false positive discoveries, mainly derived from the high sensitivity of modern mass spectrometers that confidently detect traces of unspecifically precipitating proteins. A recent approach to overcome this problem is based on the idea that reduced amounts of specific interaction partners will co-precipitate with a given target protein whose cellular concentration is reduced by RNAi, while the amounts of unspecifically precipitating proteins should be unaffected. This approach, termed QUICK for QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown4, employs Stable Isotope Labeling of Amino acids in Cell culture (SILAC)5 and MS to quantify the amounts of proteins immunoprecipitated from wild-type and knock-down strains. Proteins found in a 1:1 ratio can be considered as contaminants, those enriched in precipitates from the wild type as specific interaction partners of the target protein. Although innovative, QUICK bears some limitations: first, SILAC is cost-intensive and limited to organisms that ideally are auxotrophic for arginine and/or lysine. Moreover, when heavy arginine is fed, arginine-to-proline interconversion results in additional mass shifts for each proline in a peptide and slightly dilutes heavy with light arginine, which makes quantification more tedious and less accurate5,6. Second, QUICK requires that antibodies are titrated such that they do not become saturated with target protein in extracts from knock-down mutants.
Here we introduce a modified QUICK protocol which overcomes the abovementioned limitations of QUICK by replacing SILAC for 15N metabolic labeling and by replacing RNAi-mediated knock-down for affinity modulation of protein-protein interactions. We demonstrate the applicability of this protocol using the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii as model organism and the chloroplast HSP70B chaperone as target protein7 (Figure 1). HSP70s are known to interact with specific co-chaperones and substrates only in the ADP state8. We exploit this property as a means to verify the specific interaction of HSP70B with its nucleotide exchange factor CGE19.

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

We present a variation of the QUICK (QUantitative Immunoprecipitation Combined with Knockdown) approach that was introduced previously to distinguish between true and false protein-protein interactions. Our approach is based on 15N metabolic labeling, the modulation of affinities of protein-protein interactions by the presence/absence of ATP, immunoprecipitation, and quantitative mass spectrometry.

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

Protein Etkileşimleri keşfetmek ve HaloTag Teknoloji Kullanımı Protein Fonksiyonu Karakterizasyonu

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Nanomalzemeler Tarafından Elde Edilen Protein ve Metabolit Koronanın Karakterizasyonu için Kılcal Elektroforez Kütle Spektrometresi Yaklaşımları

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST