Bu protokol, meme kanserine bağlı ölümün agresif ve yaygın bir nedeni olan akciğer metastazını klinik öncesi meme kanseri modelinde artan hassasiyet ve verimlilikle ölçer. Orijinal teknikle karşılaştırıldığında, bu protokol araştırmacılara daha hızlı ve tutarlı sonuçlar verir. Kullanımı kolay bilgisayar teknolojisi ile insan sayma hatasını hafifletir.
Bu teknik, meme kanseri tedavilerinin akciğer metastazı üzerindeki etkilerini araştıran klinik öncesi araştırmalara, araştırmacıların başarılı tedavi sonrasında azalmış metastatik yük göstermelerine izin vererek kesinlikle genişletilebilir. Doku örneği için 15 mililitrelik konik tüp etiketleyerek başlayın. Sonra tüp tip dört kollajenaz karışımı ve 30 adet elastaz 2.5 mililitre ekleyin.
Temiz bir 1X HBSS iyi akciğer taşıyın ve kalan kan kaldırmak için forceps ile girdap, sonra boş bir 3.5 santimetre doku kültür plakasına aktarın. Makasla akciğeri doğraın, sonra 2,5 mililitre HBSS ile durulayın ve hbss'yi akciğer parçalarıyla kollajenaz ve elastaz kokteyli ile hazırlanmış 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Tüpü bir rocker veya dönen tekerlek üzerinde 4 santigrat derecede 75 dakika kuluçkaya yatırın.
Bu arada, etiket bir 50 mililitre santrifüj tüp ve her fare için bir 10 santimetre doku kültür plakası. Bir seyreltme yapıyorsanız, seyreltmeler için yeterli doku kültürü plakaları etiket. 1X HBSS ile 10 mililitreye kadar tüpün hacmini getirin, ardından içindekileri 50 mililitrelik konik tüpe 70 mikrometrelik bir süzgeç üzerine dökün.
Numuneyi süzgeçten hafifçe öğütmek için bir mililitrelik şırınganın pistonunu kullanın. Tüpü 350 kez G'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatantı atın, sonra peleti 1X HBSS'nin 10 mililitresi ile iki kez yıkayın. 60 mikromolar 6-thioguanin tam kültür medya 10 mililitre pelet resuspend ve istenirse bir seyreltme düzeni kullanarak 10 santimetre hücre kültür plakaları örnekleri plaka.
Plakaları 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle beş gün boyunca kuluçkaya yatırın. Uygun atık kabına plakalardan kültür ortamı dökün. Hücreleri düzeltmek için, her plaka ya seyreltilmemiş metanol beş mililitre ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçka, tüm plaka yıkaplar böylece metanol girdap emin olun.
Uygun atık kabına plakalar kapalı metanol dökün, sonra distile su beş mililitre ile her plaka durulayın. Plaka başına% 0.03 metilen mavisi beş mililitre ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika kuluçka, metilen mavisi çözeltisi girdap emin böylece tüm plaka kapsar. Uygun atık kabına metilen mavisi dökün ve her plakayı beş mililitre distile suyla tekrar durulayın.
Tabağı ters çevirin ve fazla sıvıyı çıkarmak için kağıt havluya doğru temizleyin. Tabağı kapağına yerleştirin ve bir gecede havanın kurumasına izin verin. Metastatik koloniler mavi olacak.
Tabaklar kuruduktan sonra oda sıcaklığında süresiz olarak saklanabilir. Etiketli kapakları plakalardan çıkarın ve numunelerin net bir şekilde tanımlanmasını sağlamaya özen tinleyin. Tüm lekeli akciğer plakalarını temiz ve aydınlık bir yüzeye yerleştirin.
Yansımaları en aza indirmek için emin olmak, iyi aydınlatılmış bir alanda plaka koleksiyonu bir resim çekmek. Plakalardaki yansımalar görüntü analizini etkileyecek ve kaçınılmalıdır. Çekilen fotoğraflara çok dikkat edin ve çeşitli açılardan birkaç fotoğraf çekin.
Plakaları fotoğrafladıktan sonra, kapakları veya arka plandaki herhangi bir şeyi dışlamak için görüntüyü kırpın. Fiji ImageJ'deki resmi açın ve görüntüyü tıklatarak, ayarlayarak ve renk eşiğine tıklayarak siyah beyaz olarak değiştirin. Ardından eşik yöntemi için varsayılan, eşik rengi için siyah ve beyaz ve renk alanı için laboratuar'ı seçin.
Koyu arka plan kutusunun seçilmediğinden emin olun. Görüntü şimdi siyah ve beyaz olmalıdır. Siyah ışık arka planı temsil eder ve beyaz mavi metastatik kolonileri temsil eder.
Çözümlenecek alanı seçmek için daire aracını kullanın. Her plakanın aynı büyüklükteki alan için analiz edildiğinden emin olmak için tüm plakalar için kullanılacak bir daire çizin. Plakaların kenarında görünen arka plan gürültüsünü en aza indirirken plakalar üzerinde analiz edilen alanı en üst düzeye çıkaran bir boyut seçin.
Boyut çizilirken araç çubuğunda görünür. Beyaz alan yüzdesini belirlemek için seçili daireyi çözümle. Parçacıkları analiz etmek ve analiz etmek için tıklayın, sonra boyut için sıfırdan sonsuza, dairesellik için sıfırdan bire ve gösterilecek hiçbir şey seçmeyin.
Özetlenmiş kutuyu işaretleyin ve tamam tuşuna basın. Daireyi merkeze alarak resimdeki bir sonraki plakaya taşıyın ve analizi tekrarlayın. Sonucu kopyalayıp elektronik tabloya yapıştırın.
Seçilen alanın beyaz yüzdesi olan yüzde alanı, metastatik yükü temsil eder. Tüm plakalar ve görüntüler analiz edildikten sonra, resimler arasındaki tutarsızlıkları azaltmak için her plaka için farklı görüntüler arasındaki yüzde alan sonuçlarının ortalamasını alın. Fiji ImageJ analizi manuel sayma ve histopatolojik analiz ile karşılaştırıldı.
Üç ayrı araştırmacı metastatik kolonileri elle saydıklarında, sonuçlar sayaçlar arasında tutarsızdı. Fiji ImageJ sonuçları, üç görüntünün her biri için sayaçlar arasında tutarlıydı. Üç görüntü ve üç sayaç sonuçları her akciğer plakası için birleştirildi.
Sonuçlar, sayaçlar arasında tutarlı sonuçlar sağlayan görüntüler arasındaki varyasyonları hesaba katmak için her plaka için ortalama olarak hesaplanmıştır. Plakaları en fazla metastatikten en az metastatik olarak sıralarken, manuel sayma en uyumlu plaka üzerinde anlaştı ama aşağıdaki tüm sıralamalar tutarsızdı. Ortalama Fiji ImageJ sonuçlarından safları sayaçları arasında çok daha tutarlı idi.
Görüntülerde yansımaları kaçınarak önemini göstermek için, bir el yansıması ve sonraki Fiji ImageJ analizi ile bir görüntü yansıması olmadan aynı plaka bir görüntü ile birlikte gösterilir. Kirli bir arka plan yüzeyinden gelen koyu lekeler veya plakalar üzerindeki kan örneği kalıntısı da Fiji ImageJ analizini olumsuz etkileyebilir. Bu kan tabakasında sadece iki metastatik koloni vardır ancak karanlık kalıntı Fiji ImageJ'in bunu %31.6 metastatik olarak düşünmesine neden olmuştur.
Bu protokolü denerken, yansıma için resimleri dikkatle incelemeyi unutmayın, görüntüdeki her plaka için aynı boyut çemberini kullanın ve her plakanın sonuçlarını en az üç ayrı görüntü arasında ortalama olarak kullanın.
