Protokol, farklılaşan oligodendrosit öncül hücreleri ve astrositler içeren nöral kök hücre türevi spontan karma kültürlerin yaşa özgü izolasyonunu, patolojik durumları taklit eden testleri ve sağlam, yüksek içerikli okumaları birleştirir. Bu özellikler, fizyolojik ve patolojik koşullarda ve astrositlerin katkısını dikkate alan bir mikroçevrimde gelişimsel miyelinasyon ve yetişkin remiyelinasyonunun farklı olarak incelenmesini mümkün klar. Embriyonik gün 13,5 ila 14,5 fetal beyinden nöral kök hücre izolasyonu için, embriyoların kafalarını buz gibi PBS'li temiz bir Petri kabına yerleştirin ve cildi büyütme altında kafatasından çıkarmak için forseps kullanın.
Beyin görünür ve deriden temizlendikten sonra, beyni kafatasından çıkarmak ve beyincikleri çıkarmak için tokalar kullanın. Menenjitleri çıkarmak ve izole edilmiş dokuyu enzimamatik olmayan ayrışma tamponu içine yerleştirmek için tokmakları kullanın. Beyin dokusunun tamamı izole edildiğinde, 1,5 mililitre tüp başına 150 mikrolitre enzimatik olmayan ayrışma tamponunda iki ila üç örnek çekin ve tüpleri sürekli sallanarak 37 santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya bırakın.
Kuluçkanın sonunda, süspansiyon kümelerden arınana kadar karıştırmak için her tüpe ve pipete 850 mikrolitre standart ortam ekleyin. Ayrışmayan doku hala görünüyorsa, dokuların tüplerin dibine yerleşmesine izin vermek için örneklerin iki dakika dinlenmesine izin verin. Ayrışma tamamlandığında, bir T25 veya T45 şişesinde 10 ila 30 mililitre nörosfer orta konsantrasyonunda mikrolitre başına 10 ila 50 hücre yoğunluğunda plaka hücreleri ve hücre bağlanmasını önlemek için şişeyi hücre kültürü inkübatörüne dikey bir konuma yerleştirin.
2,5 aylık yetişkin farelerden, dört ila beş yetişkin fareden beyinleri 50 mililitrelik bir buz soğuk HBSS tüpüne yerleştirin ve bir beyni, ventral tarafı aşağı, rostral-kaudal yönde, eksi 20 santigrat derece gece-soğuk su ile dolu steril bir alüminyum folyo kaplı şişeye yerleştirin. Koku ampullerini çıkarmak ve korteksten optik chiasma'ya iki ila üç tane bir milimetre kalınlığında koronal dilim kesmek için bir jilet kullanın. Dilimleri soğuk yüzeye ventro-dorsal bir konuma yerleştirin ve korpus callosum ve iki lateral ventrikülleri tanımlayın.
Büyütme kullanarak, lateral ventriküllerin duvarlarını izole edin, korpus callosum parçalarını içermemeye dikkat edin ve izole edilmiş dokuyu 37 santigrat derecede 15 dakikalık bir inkübasyon için beş ila 10 mililitre enzimatik ayrışma tamponuna yerleştirin. Kuluçkanın sonunda, örnekleri 37 santigrat derecede 10 dakika daha kuluçkaya yatırmadan önce dokuları en az 50 kez pipetleyin. Kuluçkanın sonunda, trypsin'i beş mililitre standart kültür ortamı ile nötralize edin ve doku süspansiyonunu 70 mikronluk bir filtreden filtreleyin.
Filtrelenmiş çözeltiyi 400 kez g'da beş dakika santrifüjleyin ve peletin ikinci bir santrifüjleme için sakkaroz çözeltisinde yeniden askıya alın. Santrifüjlemenin sonunda, sığır serumu albümin yıkama solüsyonunda peleti başka bir santrifüjleme için yeniden askıya alın, ardından hücreleri dik bir T-25 veya T-45 şişesinde saymak ve kaplamak için standart kültür ortamında peleti yeniden askıya alın. Primer nörosfer farklılaşması için, nöral kök hücre kültürüne her iki günde bir temel fibroblast ve endotel büyüme faktörleri ekleyin.
Nörosferler 100 ila 500 mikronluk bir çapa ulaştığında, hücreleri standart protokollere göre mekanik ayrışma ile geçiştirir. Oligosfer farklılaşması için, her iki günde bir trombosit türevi faktör-AA'da temel fibroblast büyüme faktörü ile hücreleri tedavi edin. Oligosferler 100 ila 150 mikron çapa ulaştığında, küreleri standart protokollere göre mekanik ayrıştırma ile ayrıştırın ve hücre süspansiyonunu poli-DL-ornitin laminin kaplı plakalara santimetrekare başına 3000 hücre yoğunluğunda tohumlayın.
Üç gün sonra, her kültürün üst öğesini aynı hacimde oligodendrosit farklılaşma ortamıyla değiştirin. nörosfer ayrışmasından sonra ve oligosfer üretimi sırasında iltihap aracılı bir farklılaşma bloğu indüksiyonu gerçekleştirmek için, kültür ortamına ilginin sitokin karışımını ekleyin. Oksijen-glikoz yoksunluğu hücre ölümünü teşvik etmek için, çok kuyulu plakalara tohumlamadan iki gün sonra, her kültürden süpernatant'ı çok kuyulu bir plakanın bireysel kuyularına aktarın.
Kuyulara OGD ortamının yarısını ekleyin ve kültürleri% 95 azot ve% 5 karbondioksit ile doymuş hava geçirmez bir hipoksi odasına aktarın. Odayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Üç saat sonra, odalardaki ortamı çok kuyulu kültür plakasından ayrılmış ortamla değiştirin.
Hücre boyama kalitesini kontrol ettikten sonra, yüksek içerikli tarama yazılımının Edinme menüsünde Sabit pozlama süresi ve Mini tarama'yı seçin ve tüm plaka için alanların alt kümesindeki analiz parametrelerinin ayarlanabilmesi için kuyu başına 10 alan ve deneysel durum başına iki kuyu seçin. Tüm algoritmayı geliştirmek için iş akışını adım adım izleyin. Her kanal için Görüntüyü işle'yi seçin ve istenen sinyal düzeyini seçmek için Arka Plan kaldırma'yı tıklatın.
Çekirdekleri nükleer boyama ile tanımlamak ve seçmek için Birincil nesneyi tanımla'yı tıklatın, tek çekirdeği tanımlamak için eşiği ayarlayın ve nesne alanlarına ve konuma göre eşikleri ayarlamak için Birincil nesneleri doğrula'yı tıklatın. Belirli soy işaretçilerine karşılık gelen her kanal için noktaları tanımla'yı tıklatın ve sitoplazmatik floresan tanımlamaya izin vermek için halka değeri genişliğini üçe ve mesafeyi sıfıra ayarlayın. Analizi oluşturmak ve yoğunlaştırılmış çekirdeklerin nükleer boyuta ve nükleer boyama yoğunluğuna ve halka tarafından tanımlanan sitoplazmatik floresan bazlı belirli işaret pozitif hücrelerin otomatik sayımına izin vermek için iş akışında Referans düzeylerini seçin, ardından Oynat'ı tıklatın.
Kültürün ilk aşamasında, sinirsel kök hücreler nestin ifadelerini korur. Hücrelerin çoğunluğu da NG2 pozitiftir. Pre-oligodendrosit evresine karşılık gelen CNPase pozitif hücreler T3 aracılı farklılaşma indüksiyonu sonrası üç ila altı gün sonra saptenebilirken, olgun MBP pozitif oligodendrositler altı ila 12 günlük in vitrodan sonra önemli bir yüzdede ortaya çıkar.
Yüksek içerikli tarama analizi, nükleer boyama ve floresan yoğunluğu analizi ile kültür içindeki tek hücrelerin tespitini sağlar. Farklılaşma evresinin sonunda kültürün bileşimi, kültürlerin fetal veya yetişkin kökenli olup olmadığına bağlı olarak, fetal kültürlerin T3 aracılı farklılaşmaya daha duyarlı olduğuna ve olgun oligodendrositlerin daha yüksek bir yüzdesine ulaştığına bağlı olarak farklılık gösterir. Nöral kök hücre türevli oligodendrosit öncül hücreleri yüksek yoğunlukta tohumlandığında, astrositleri bir araya toplar ve çoğaltırlar, hızlı bir şekilde birleştiği hücre tabakası üretirler ve olgun oligodendrositlerin karakteristik örümcek ağı şeklinin gözlemlenmesini önlerler.
İnflamasyon aracılı, farklılaşma engelleme, hem fetal hem de yetişkin kültürlerinde CNPase ve MBP lekelemesinde tespit edildiği gibi, pre-ve olgun oligodendrositlerde güçlü bir azalmaya neden olur. Sitokinle tedavi edilen yetişkin kültürlerinde de oligodendrosit öncül hücrelerinin sayısında bir artış meydana gelir. Fetal ve yetişkin oligodendrosit öncül hücreleri inflamatuar sitokin maruziyetine aynı şeyi gösterirken, sadece fetal türevli kültürler oksijen-glukoz yoksunluğu toksisitesine duyarlıdır.
Yöntem, miyelinasyon veya remiyelinasyonu etkileyen hastalıklarla mücadele etmeyi amaçlayan yeni stratejileri test etmek için her türlü oligodendrosit öncü hücreleri, farklılaşma ve olgunlaşma müdahale süreci ile uygulanabilir.
