Bu protokol önemlidir, çünkü lipid filminden lipid çözeltisine ve daha sonra damlacıklara damlacık oluşturmak için tam prosedür sağlar. Bu tekniğin ana avantajı, mikrobubbles damlacıklara yoğuşma basitliğidir. Sadece soğutularak ve dönerek, basınçlandırmaya gerek kalmadan damlacıklar yapılabilir.
Görsel bir gösteri kritiktir, çünkü mikrobubbles başarıyla yoğunlaşıp yoğunlaşmadığını görmek için basit bir test, yarı saydamlıktaki değişimi görsel olarak kontrol etmektir. Prosedürü gösteren, Gang Zheng laboratuvarında yüksek lisans öğrencisi olan Kimoon Yoo olacak. Bir dekapper kullanarak, serum şişesinin üzerindeki alüminyum contayı çıkarın ve lipid çözeltisinin bir mililitresini, lipit çözeltisinin kabarcık oluşturmadan iç duvardan akmasına izin vererek fenol vidalı kapaklı 1,85 mililitrelik borosilikat cam numune şişesine aktarın.
1,85 mililitrelik numune şişesi ile gaz eşanjörunu kullanarak numune şişesi kafa boşluğuna decafluorobutane gazında akmaya hazır olun. Gaz eşanjöründeki tüm vanaların düzgün bir şekilde kapatıldığından ve pompanın kapalı olduğundan emin olun. Manifold vanasını açın ve karşılık gelen iğneyi manifolddan dikkatlice ısıtın.
Açık basınç valfi A ve basınç valfi B ve gaz silindiri vanasını yaklaşık 1/16 ila 1/8 saat yönünün tersine çevirerek kısmen açın. T kolu vanasını açın ve örnek şişeyi lipid çözeltisi ile açın. Manifold iğnesini şişenin sıvı hava arayüzünün üzerine yerleştirin, hava regülatörü iğnesi dinlenme konumundan hafifçe hareket edene kadar hava regülatör vanasını yavaşça saat yönünde çevirin ve perflorokarbon gazının şişe kafa boşluğuna hafifçe akmasını bekleyin, kabarcıklar oluşturmamaya dikkat edin.
Gerekirse hava regülatör vanasını ayarlayın. 30 saniye sonra, şişeyi çok fazla hareket ettirmeden numune şişesini dikkatlice ve hızlı bir şekilde tuttu. Hem gaz silindir valfi, hem T kolu valfi, hava regülatör valfi, basınç valfi A, basınç valfi B ve manifold valfi.
İğneyi dikkatlice kılı şerileyin, sonra numune şişesini etiketleyin ve boynu saat yönünde giden balmumu filmiyle kapatın. Numune şişesini karanlıkta ve dört santigrat derecede en az 10 dakika veya 24 saate kadar saklayın. Yaklaşık 100 gram kuru buzu yalıtımlı bir kaba, normal buzları başka bir yalıtımlı kaba yerleştirin.
Önceden hazırlanmış bir kafeunsuz serum şişesini 1,5 inç 20 kalibre iğneye, bir mililitre plastik şırıngaya, 200 mililitrelik bir kap, metal maşalara ve bir termometreye alın. Örnek şişeyi lipid çözeltisi ile mekanik karıştırıcıya yerleştirin ve 45 saniye boyunca ajite edin. Renk ve yarı saydamlıkta bir değişiklik olmalıdır.
Mekanik ajitasyondan sonra, numune şişesini ışıktan korumalı olarak sağ tarafta bekletin ve şişeyi soğutmak ve mikrobubbles'ı seçmek için 15 dakikalık bir geri sayım başlatın. Geri sayım 10 dakikaya ulaştığında, bir kabı yaklaşık 200 mililitre izopropanol ile doldurun ve metal maşalar kullanarak kuru buzla eksi 20 santigrat dereceye kadar soğutun. Mikrobubbles 15 dakika boyunca seçildikten sonra, örnek şişenin içinde seçilen bölümün boyutunu arayın.
Numune şişesini sağ tarafta tutarak, numune şişesini dikkatlice çözün ve bir mililitre plastik şırıngaya bağlı 1,5 inç 20 kalibrelik bir iğne ile alt bölmenin yaklaşık 0,7 mililitresini geri çekin. Üst bölmenin hiçbirinin çekilmediğinden emin olun ve şırındıcı hava ceplerini çıkarmak için kaydırmayın. Kauçuk durdurucu üzerindeki orta daireyi hedef alarak, iğneyi serum şişesinin tepesine yakın tutarken bir kafeunsiz serum şişesine farklı bir 20 kalibrelik iğne yerleştirin ve ardından iğneyi seçilen mikrobubbles boyutunda yerleştirin.
Seçilen mikrobubbles boyutunu yavaşça aktarın. Sıvının kafeunsiz serum şişesinin iç duvarından hafifçe aşağı kaymasına izin verin. Seçilen tüm boyut mikrobubble çözeltisi aktarıldıktan sonra, şırınga ile iğneyi çıkarın, ancak negatif basıncı hafifletmek için havalandırma iğnesini içinde tutun.
Banyo sıcaklığının eksi 15 ila eksi 17 santigrat derece arasında olmasını sağlamak için izopropanol banyosuna az miktarda kuru buz veya oda sıcaklığı izopropanol ekleyin. Serum şişesinin üstüne yerleştirilen 20 kalibrelik havalandırma iğnesi ile serum şişesini ve izopropanol banyoyu yerleştirin, mikrobubble seviyesini izopropanol seviyesinin altında tutun, ancak şişe boynu üzerindeki ve zaman zaman serum şişesini mikrobubbles'ı yoğunlamak için iki dakika döndürdü. Serum şişesini izopropanolde sürekli döndürmeyin ve çözeltinin donmasına izin vermeyin.
Yaklaşık beş saniye döndürün ve serum şişesini izopropanolden kaldırın. Buz çekirdeğini kontrol edin, sonra izopropanolde dönmeye devam edin. Buz oluşumu varsa, serum şişesini dağılana kadar havada döndürün.
İki dakikalık yoğuşmadan sonra serum şişesini izopropanol banyosundan çıkarın ve havalandırma iğnesini çıkarın. Mikrobubbles yarı saydamlık değişikliği ile belirtildiği gibi damlacıklar halinde yoğunlaştırılmış olmalıdır. Serum şişesini silin, etiketleyin ve kullanıma hazır olana kadar koyu yalıtımlı bir kapta normal buza yerleştirin.
Bozulmamış alüminyum contalı açılmamış damlacıklar, erimiş buz gerektiği gibi değiştirildiği sürece altı saate kadar sabit olmalıdır. Kullanıma hazır olduğunuzda, alüminyum contayı dekar ile çıkarın. Bu protokolü kullandıktan sonra, önceden yoğunlaştırılmış, boyutlandırılmış seçilen mikrobubbles ve yoğuşma sonrası damlacıklar 10 mikron diyafram açıklığına sahip bir Coulter tezgahında boyutlandırıldı.
%30 pyro-lipid formülasyonu için boyutlandırma verileri gösterilir. Boyutlandırma verilerine dayalı istatistikler burada gösterilmiştir. Önceden ve sonra yoğunlaştırılmış ortalama çapların bir oranını kullanarak, sonuçlar piro-lipid içeriği arttıkça konsantrasyonun azaldığını ve ortalama çapın arttığını göstermiştir.
%30 pyro-lipid damlacık örneğinin temsili emici ölçümleri gösterilmiştir. Bu, sağlam montajların, birleştirilmemiş lipit bileşenlerine kıyasla farklı tepe noktası tarafından yansıtıldığı gibi farklı optik özelliklere sahip olduğunu göstermiştir. Önceden yoğunlaştırılmış mikrobubblenin temsili floresan ölçümleri, %30 pyro-lipid ile yoğunlaştırılmış damlacık örneği burada gösterilmiştir ve bozulan formdaki bozulmamış numuneler için farklı floresan zirveleri göstermektedir.
Farklı basınçlarda gösterilen %30 pyro-lipid damlacık örneğinin temsili ultrason görüntüleri gösterilmiştir. Düşük basınçlarda, sadece agar sentezinden sıkışmış hava kabarcıklarından gelen arka plan sinyali gözlendi. Biraz daha yüksek bir güçte, parlak beneklerin ortaya çıkmasıyla gösterilen birkaç mikrobubble üretildi.
Basınç arttıkça daha fazla mikrobubble üretildi. Buradaki yoğuşma sıcaklığının bu özel damlacık kabuğu formülasyonu için optimize edilmiş olduğunu hatırlamak önemlidir. Farklı kabuk formülasyonları farklı bir sıcaklık gerektirebilir.
