Proteinlerin fonksiyonları sıcaklığa bağlıdır ve sıcaklıkta optimaldir. Bu protokol, protein yapılarını daha yüksek sıcaklıklarda çözmenin bir yolunu sağlar. Bu yaklaşım, işlevsel olarak ilgili yapıları sağlayabilir ve protein yapılarının sıcaklığa bağımlılığının anlaşılmasını artırabilir.
Prosedürü gösteren, Academia Sinica Cryo EM tesisinin Müdürü Yuan-Chih Chang olacak. Kapalı ucundaki 50 milimetrelik bir santrifüj tüpünde bir santimetrelik bir delik açarak başlayın. Tüpü ultrasonik su çıkışındaki vitrifikasyon aparatı odasına yerleştirin.
Vitrifikasyon aparatı sıcaklığını belirtilen sıcaklığa ayarlayın ve vitrifikasyon aparatı odasının 55 santigrat dereceye ve% 100 bağıl neme ulaşmasına izin verin. Deneye başlamadan önce koşulları stabilize etmek için en az yarım saat bekletin. Su banyosunu bir sıcak plakaya yerleştirin ve sıcak plakayı istenen sıcaklığa ayarlayın.
Suyun 55 santigrat dereceye ulaştığından emin olmak için bir termometre ile kontrol edin. Numuneyi su banyosunda inkübe edin ve kurutma deneyinden önce sıcak plakanın kenarındaki pipet ucunu iki dakika veya daha uzun süre önceden ısıtın. Işıltı, 25 miliamperde delikli karbon destekli bir ızgarayı 30 saniye boyunca boşaltır.
Vitrifikasyon filtre kağıdını, lekeleme deneyinden en geç beş dakika önce vitrifikasyon aparatı odasına yerleştirin. Cımbızları vitrifikasyon aparatındaki ızgara ile iki dakika veya daha uzun süre inkübe edin. Etan kabını standart prosedürlere göre etan ile inşa edin ve etanın taşmamasını sağlayın.
Numunenin yedi ila dokuz mikrolitresini ızgaraya uygulamak için bir pipet kullanın. Ardından bir ila iki saniye bekleyin, bir ila bir buçuk saniye lekeleyin ve numuneyi hızlı bir şekilde sıvı etan'a batırın. Izgarayı sıvı etandan sıvı azotta depolanan kriyo kutusuna aktarın.
Elektron mikroskobu veya Cryo EM cihazı elde etmek için ızgaraları kırpın ve boşaltın. Cryo EM cihazının ekran ekranını ve yazılımın düşük doz fonksiyonunu kullanarak ızgaradaki buz durumunu ve numunenin ızgaradaki dağılımını görüntüleyin. Elde edilen ızgaranın kalitesi iyi değilse, ızgara hazırlama işlemini bekleme süresi, lekelenme süresi vb. gibi çeşitli koşullarla tekrarlayın.
Elde edilen ızgaranın kalitesi iyiyse, ızgaraları farklı bir sıcaklıkta yapmak için aynı adımları tekrarlayın. Kaliteli ızgaraları yüksek çözünürlüklü bir Cryo EM cihazına aktarın. Belirlenen prosedürlere göre veri toplama ve veri analizleri gerçekleştirin.
Başarılı ızgara durumunda, ızgaranın sol üst köşesinde daha kalın buz ve sağ altta daha ince buz ile bir buz gradyanı oluşur. Başarılı ızgarada veri toplamaya uygun mavi ve yeşil kutular gözlenmiştir. Diğer ızgarada parlak bir kontrast gözlendi.
İnce bir tabakayı, buz tabakasını veya buz yokluğunu gösterir. İkinci ızgarada veri toplama için sadece iki karenin uygun olduğu bulunmuştur. Izgaralardan biri, çoğunlukla veri toplama için uygun olmayan kristalin formundaki buzdan oluşuyordu.
Öte yandan, diğer ızgara buz tabakasının çoğunlukla veri toplama için uygun amorf bir durumda olduğunu gösterdi. Bir kap olarak hazırlanması ve diğerlerinin bir zaman noktasına göre tamamlanması gerekir. Zaman kontrolü ve deneyin hızlı ve doğru bir şekilde bitirilmesi en önemlisidir.
Bu protokol kullanılarak elde edilen sonuçlara bağlı olarak, araştırmacının basit koşulları oluştururken daha dikkatli olması gerekebilir.
