Doğru Ortalama Kare Yer Değiştirme Yönteminin Görüntülenmesi, canlı bir numunedeki hedef biyolojik nesnenin hem yapısını hem de dinamik ortalama özelliklerini aynı anda çıkarabilir. Doğru Ortalama Kare Yer Değiştirmeyi görüntülemek, tek nesne yörüngelerini çıkarmaya ve karmaşık etiketlemeye gerek kalmadan hızlı ve sağlam bir prosedürdür. Sadece standart bir optik kurulum ve floresan etiketli bir ilgi nesnesi gerektirir.
Yöntem, kanser, diyabet veya nöro-dejeneratif bozukluklar gibi çeşitli patolojik durumlarda hücre altı nano-yapılar düzeyinde bulunan yapısal ve dinamik değişikliklerin büyük ölçekli, kantitatif taramasına yol açmaktadır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan doktora öğrencisi olan Fabio Azzarello olacak. Hücreleri alt kültürlemeye başlamak için, 10 santimetrelik doku kültürü ile muamele edilmiş bir konfluent hela hücresi kabını, 0.01 molar PBS ile iki kez yıkayarak başlayın.
Daha sonra, 1 mililitre% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve kabı beş dakika boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ayrılan hücreleri 9 mililitre tam DMEM ortamında yeniden askıya alın ve santrifüj tüpünde tripsin ile 10 mililitre toplam ortam toplayın. Her 35 milimetre x 10 milimetre çanakta yaklaşık 0,2 milyon hücreyi tohumlayın ve son orta hacmi 1 mililitredir ve daha sonra hücreleri inkübe edin.
İlgilenilen hücre altı yapısına bağlı olarak, belirli bir etiketleme yöntemi gereklidir ve etiketleme çözeltisi hazır olduğunda, hücreleri 0.01 molar PBS ile iki kez yıkayın. PBS'yi boya reaktifi içeren ortam ile değiştirdikten sonra, üreticinin tavsiyesine göre kabı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Kuluçkanın sonunda, deneyden önce hücreleri iki kez taze bir ortamla yıkayın.
Hızlandırılmış seri alımını gerçekleştirmeden önce, mikroskop inkübatör kontrol sistemini açın ve mikroskopun yaklaşık iki saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte dengelenmesine izin verin. Transfekte hücrelerde EGFP'nin uyarılması için 488 nanometrelik bir argon lazer ve floresan etiketli Makropinozomlar kullanın ve standart bir fotoğraf çarpanı tüp dedektörü kullanarak 500 ila 600 nanometre arasındaki floresan emisyonunu toplayın. Floresan boyayı uyarmak için 543 nanometre helyum neon lazer kullanın ve 555 ila 655 nanometre arasındaki emisyonu toplayın.
Algılama iğne deliğinin çapını bir Eri boyutuna ayarlayın. Ve her edinme için bir dizi 1000 sıralı çerçeve toplayın. 129 milisaniyelik bir kare süresi için piksel bekleme süresini piksel başına 2 mikrosaniye olarak ayarlayın.
Edinimlerin araçsal parametrelerini düzgün bir şekilde başlatmak için iMSD'yi açın. Yazılım metin editörü ile M. N'as için zaman serisindeki kare sayısını, mikrometre cinsinden piksel boyutunu ve saniye cinsinden zamansal çözünürlüğü f'as değerlerini yazarak parametreleri ayarlayın.
Ayrıca, ham görüntüleri işlemek için filtre arka plan düzeltme girişini sıfıra veya eşik tabanlı bir arka plan çıkarma işlemi gerçekleştirmek için bir taneye ayarlayın. Ardından, arka plan düzeltmesi için AV geçiş ücreti eşiğini ayarlayın. Filtre değeri bir olarak ayarlanırsa, yoğunluğu eşik değerinden daha düşük olan pikseller sıfır olarak ayarlanır.
Ardından, biti yoğunluk örneklemesini belirleyen tamsayı sayısı olarak ayarlayın. Düzenlenen iMSD'yi kaydedin ve çalıştırın. M komut dosyası.
Komut penceresinde komut dosyasının yürütülmesini kontrol edin ve herhangi bir sorun oluşursa, kesintiye uğramış uyarı mesajı görüntülenecektir. Başarılı komut dosyası yürütmesinden sonra, görüntü yığınını içe aktarın ve gerekirse arka planı çıkarın. Ardından, Fourier yöntemini kullanarak spacio-temporal korelasyon fonksiyonunu hesaplayın.
Uzay-zamansal korelasyon fonksiyonunu 2B Gauss fonksiyonu ile eşleştirin. Ardından, kullanılan farklı bağlantı denklemi türleri için üç ayrı panelde görüntülenen IMSD eğrisi ve karşılık gelen bağlantı eğrileri ile grafik çıktıyı kontrol edin. R-kare değerleri grafik göstergesinde sağlanır.
Ardından, metin çıktısını kontrol edin. Lizozomun bir test organeli olarak görüntü alımı, canlı hücrelerde uygun zamansal çözünürlükte ve çok düşük zamansal çözünürlükte gerçekleştirildi. Organel hareketine bağlı olarak lizozomun yapay deformasyonu, düşük çözünürlüklü görüntüde görülebiliyordu.
Noktanın yoğunluk profili, görüntü analiz yazılımındaki bir çizgi aracı kullanılarak türetilmiştir. Daha sonra, nokta çapı tahmini, yoğunluğu bir Gauss fonksiyonu ile çizerek ve enterpolasyon yaparak gerçekleştirildi. Yüksek hızda satın alma, sabit numuneye yakın karşılaştırılabilir bir ortalama yapı boyutu sağladı.
Bunun yerine, yavaş bir hızda edinim, görüntüleme sırasındaki doğal yapı dinamikleri nedeniyle yapı boyutunu arttırdı. Makropinozomların yapısal ve dinamik özellikleri, kaçakçılık sırasında gözlemlenmiştir. Gözlemler, Makropinozomların ortalama boyutunda bir azalma olduğunu ortaya koydu.
Alt difüzyon hareketindeki eşzamanlı artış, azalmış alfa değerleri ile gösterilmiştir. Her edinim için, zamanla Makropinozomların sayısındaki artış gözlenmiştir. Buna karşılık, ISG'ler üzerinde yapılan benzer ölçümler, bu son organellerin Makropinozomlara kıyasla çok farklı bir davranışını ortaya koymuştur.
Aslında, insülin granülleri değişmemiş, ortalama yapısal veya dinamik özellikler gösterir, bu da sabit bir durumda incelendiklerini düşündürür. Yöntem, iki ayrı hücre altı organel farklı şekilde etiketlenirse, çift renk modunda kolayca uygulanabilir. Bu durumda, çapraz korelasyon analizi, hücre içindeki iki nesnenin potansiyel dinamik etkileşimlerini vurgulayacaktır.
