Bu protokol, sağlam bir organizmada gen ekspresyonünü teşvik etmek için optogenetik veya ışıkla aktive edilmiş bir yöntem olduğu için önemlidir. Bizim durumumuzda, zebra balığı embriyosu. Bu tekniğin avantajı, indüksiyonun çok hassas, spasiyal ve zamansal kontrolüne izin veren bir indükleyici ajan olarak ışığı kullanmasıdır.
Bu protokol, indüklenebilir gen ekspresyonlarının yararlı olacağı her durum için yararlı olacaktır. Bu, soy izleme, işlev kazanım tahlilleri veya kurtarma deneyleri gibi şeyleri içerir. Led paneli, aynı anda birkaç embriyoya santimetrekare ışık gücü başına 1,5 miliwatt teslim etmek için embriyo içeren Petri tabaklarına göre konumlandırmak için.
Kuyruk Transkripsiyonal Aktivatör'ün fotoğraf hasarı riskini azaltmak için, ışığı üç saatten fazla aydınlatıyorsa, bir zamanlayıcı rölesi kullanarak bir saat açık aralıklarla yayınlayın. Yoğuşmadaki hafif saçılmaları en aza indirmek için Petri kabı kapaklarını çıkarın. Kontrol embriyoları ve koyu kontroller için ışık geçirmez bir kutu içeren Petri tabakları yerleştirin.
İstenilen aktivasyon süresinden sonra embriyoları aydınlatmadan çıkarın. Toplam RNA ekstraksiyonu için bir RNA çıkarma kiti kullanın. Embriyoları 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve fazla yumurta suyunu çıkarın.
Lizis tamponu ekledikten sonra, embriyoları plastik pestle ile homojenize edin. Lisat'ı sağlanan bir kit sütununa aktarın ve RNA'yı arındırmak için üreticinin talimatlarını izleyin. Saflaştırılmış RNA'yı eksi 20 ila eksi 80 santigrat derecede saklayın, ta ki üreticinin talimatını izleyerek cDNA sentez kitini kullanarak bir mikrogramdan, toplam RNA'dan cDNA'yı kullanana veya hemen sentezleyene kadar.
İnce bir duvara bir mikrogram RNA ekleyin 0.2 mililitre, PCR tüpü, dört mikrolitre içeren, beş kez cDNA reaksiyon ana karışımı, ardından bir mikrolitre ilavesi, 20 kez ters transkriptaz enzim çözeltisi. Daha sonra nükleoz içermeyen su ile 20 mikrolitrelik son bir hacim oluşturuyor. Tüpü cDNA sentezi için programlanmış bir Termo çevrim içine yerleştirin.
Sentezlenen cDNA'yı kullanıma kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın veya nicel değerlendirme için hemen kullanın. Siber yeşil enzim ana karışımını içeren nicel PCR reaksiyonlarını ayarlayın. Üç taraflı 325 nanomolar konsantrasyonda beş kat seyreltilmiş cDNA ve GFP astarları ve reaksiyonu programlanmış gerçek zamanlı bir PCR makinesinde gerçekleştirin.
Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, reaksiyon özgüllüğünü belirlemek için erime eğrisini analiz edin. Çift Delta CT yöntemini kullanarak kontrol embriyolarına göre kat değişimi olarak ışıkla aktive indüksiyonu hesaplayın. Ve önemini belirlemek için istatistiksel yazılım kullanın.
Embriyoları aydınlatmadan çıkardıktan sonra cam çökelti slaytlarında %0.01 Trikain içeren %3 metilselülozda görüntüleme için embriyoları hareketsiz hale verin. Standart GFP filtre ayarlarını kullanarak dijital kameraya bağlı floresan stereo mikroskopta floresan ve parlak alan görüntüleri elde edin. Satın alma işleminden sonra brightfield ve floresan görüntüleri görüntü işleme yazılımıyla birleştirin.
GFP ekspresyonunun nicelleştirilmesi, mavi ışığa maruz kaldıktan 30 dakika sonra ifadenin indüksiyonunu gösterdi. GFP ifade düzeyleri daha sonra aktivasyon sonrası istikrarlı bir şekilde altı saate kadar artmaya devam etti. GFP indüksiyonu da aktivasyon sonrası aynı zamanda floresan yoğunluğu incelenerek niteliksel olarak değerlendirildi.
Arka plan seviyelerinin üzerindeki GFP floresan ilk olarak aktivasyon sonrası üç saatte gözlendi ve aktivasyon sonrası altı saatte belirgin şekilde daha parlak hale geldi. Buna karşılık, karanlıkta tutulan tüm zaman noktaları için embriyoları kontrol eder, kayda değer bir GFP floresan sergilemedi. Etkinleştiren ışık, görünür ışık spektrumunun mavi aralığında olmalıdır.
Hem oda ışığı hem de güneş ışığı biraz mavi ışık içerir. Bu nedenle, negatif kontrollerinizi ortam ışığı kaynaklarından korumaya özen göster. TAEL C120 sistemi, genetik olarak kodlanmış ve modülerdir ve herhangi bir ilgi geninin ekspresyonini yönlendirebilir.
Bu nedenle, diğer tekniklerle birlikte, bir dizi biyolojik soruyu cevaplamak için kullanılabilir.
