Bu protokolün temel avantajı, Mycobacterium tuberculosis'in hücre içi büyümesini tahmin etmek için koloni oluşturan birimleri saymanın geleneksel yönteminden daha az emek yoğun ve zaman alıcı olmasıdır. Bu teknik, araştırmacıların FDA onaylı ilaçları, tüberkülozu tedavi etmek için konakçı tarafından yönlendirilen tedaviler olarak yeniden kullanmak amacıyla hızlı bir şekilde taramalarını kolaylaştırır. Yöntem çok basit ve anlaşılırdır.
Mikobakteriyel ve YG taşıyıcı T-hücre kültürü tekniklerinin temel bilgisi, protokolü adım adım takip etmek için yeterli olacaktır. Başlamak için, altı ila sekiz mililitre zayıflatılmış mikobakteriyel kültür H37Ra'yı T25 şişesinden 15 mililitrelik bir polipropilen tüpe aktarın. Tüpü tezgah üstü bir santrifüjde santrifüj yapın.
Tüpü dikkatlice çıkardıktan sonra, tüpü biyolojik güvenlik kabinine aktarın ve bakterilerin yerleşmesi için bir dakika bekleyin. Süpernatantı dezenfektan atma kabına dökün. Daha sonra, tüpü özetleyin ve tüpün yan tarafına hafifçe dokunarak ve bakterilerin bir dakika boyunca yerleşmesine izin vererek bakterileri kalan ortamda askıya alın.
İki mililitre önceden ısıtılmış tam RPMI ekleyin ve karıştırın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Mikobakterileri yeniden askıya almak için, süspansiyonu 25 gauge iğne ile donatılmış beş mililitrelik bir şırıngada hazırlayın. Daha sonra, aerosol üretimini en aza indirmek için tüpün yan duvarından çok nazikçe aşağı doğru çıkarın ve işlemi altı ila sekiz kez tekrarlayın.
İğneyi ve şırıngayı biyogüvenlik kabinindeki keskin bir kaba atın. Süspansiyonu iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve kalan kümeleri peletlemek için santrifüj yapın. Tüpü güvenlik kabinine geri koyun ve bakterilerin bir dakika boyunca yerleşmesine izin verin.
Süpernatantın üst 1 ila 1,5 mililitresini yeni bir tüpe aktarın. Orijinal tüpü dezenfektanı içeren atık kovasına atın. İyice karıştırın ve iki kuyu cam hazneli slayta çeşitli miktarlarda mikobakteriyel süspansiyon ekleyin ve slaytları 37 santigrat derecede üç saat boyunca inkübe edin.
Fagositozlu olmayan bakterileri yerinden çıkarmak için üç kez yukarı ve aşağı pipetleme yaptıktan sonra, ortamı cam hazne kaydırağından çıkarın. İki mililitre PBS ile bir kez yıkayın. PBS'de eksi 20 santigrat derecede saklanan% 4 PFA'lık alikotları çözün.
Aliquot'u% 2 PFA'ya seyreltin ve her bir oyuğa iki mililitre ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra, lekelenme için sürgüyü güvenlik kabininden çıkarın. PFA'yı PFA kimyasal atık kabına atın ve sürgüyü yumuşak bir musluk suyu akışı altında yıkayın.
Plastik bir transfer pipeti kullanarak, slayttaki hücreleri örtecek kadar auramin dağıtın ve slaytı karanlıkta oda sıcaklığında bir dakika boyunca inkübe edin. Fazla boyayı musluk suyuyla kaydıraktan yıkayın ve karanlıkta bir dakika boyunca söndürücüyü ekleyin. Fazla susturucuyu yıkadıktan sonra, karanlıkta Hoechst lekesi ile oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
Sonra Hoechst lekesini yıkayın. Fazla suyu boşalttıktan sonra, bir damla antifade ve bir kapak kayması ekleyin. 100x yağ hedefini kullanarak floresan mikroskop altında hava ile kurutulmuş slaytı inceleyin.
Mikobakteriler Fitz filtresi altında yeşil floresan oluşturacak ve çekirdekler DAPI filtresi altında mavi floresan yapacaktır. MOI'yi belirlemek için hücre başına fagositozlu mikobakteri sayısını ve enfekte hücrelerin yüzdesini sayın. Plakadaki bir kuyunun yüzey alanına bağlı olarak gerekli MOI'yi elde etmek için gereken mikobakteriyel süspansiyonun hacmini hesaplayın.
Mikobakteri süspansiyonunu karıştırdıktan sonra, istenen MOI'yi elde etmek için hesaplanan hacmi 12 kuyucuk plakasındaki hücrelere ekleyin. Mikobakterilerin fagositonize edilmesine izin vermek için plakayı üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra kuyucukları birkaç kez ılık RPMI ile yıkayarak hücre dışı bakterileri çıkarın.
Makrofajları üç saatlik numunenin bir kuyucuğunda lize etmek için 10 dakika boyunca 500 mikrolitre lizis tamponu ekleyin ve temel enfeksiyon oranını belirlemek için lizatı toplayın. Ardından, kalan kuyucuklara taze tam RPMI ve gerekli ilaç dozlarını veya araç kontrolünü ekleyin. Deney tasarımına bağlı olarak, karbondioksit inkübatöründeki plakaları bir ila sekiz gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Üç saatlik numunenin ilk inokulumunun pozitiflik yüzdesini veya TTP'yi belirlemek için, sıcak Middlebrook suyu ve enstrüman kültürü şişeleri oda sıcaklığına kadar. Ortamı 12 delikli plakadan ilgili etiketli konik tüplere aktarın ve her bir kuyucuğa 500 mikrolitre steril lizis tamponu ekleyin. 10 dakika sonra, hücreleri steril bir kazıyıcı ile kuyudan yavaşça kazıyın ve uygun konik tüpte ortamla birleştirin.
Kuyu 0,5 mililitre steril PBS ile yıkandıktan ve ortam ve lizat ile birleştirildikten sonra, her numuneyi altı ila sekiz kez 25 gauge iğneli bir şırıngadan yavaşça geçirerek kümeleri kırın. 100 mikrolitre numuneye 900 mikrolitre MB et suyu ekleyerek numuneyi MB et suyunda seyreltin ve inkübasyon sırasında gerekli zaman noktalarında hasat işlemini tekrarlayın. Kauçuk kapağı% 70 alkol ile sterilize ederek gösterge tablosu şişelerini hazırlayın.
Tüm numuneler için yeterli besin takviyesini konik bir tüpe aktarın ve enstrüman kültürü şişesine 0.5 mililitre besin takviyesi enjekte etmek için bir iğne ve şırınga kullanın. Daha sonra, bir mililitrelik v tabanlı bir tüpte 10'da bir seyreltilmiş numunenin 500 mikrolitresini pipetleyin. 500 mikrolitre numuneyi atanan enstrüman kültürü şişelerine enjekte etmek için bir iğne ve şırınga kullanın.
Şişeleri biyogüvenlik kabininden yükleme cihazına dikkatlice taşıdıktan sonra, otomatik mikrobiyal algılama sistemindeki "yükleme" düğmesine basın. Enstrüman kültürü şişelerindeki barkodları tarayın ve şişeleri 42 güne kadar 37 santigrat derecede algılama sistemi inkübatörüne yerleştirin. Cihaz ekranından pozitifliğe ulaşmak için geçen süreyi okuyun ve kaydedin ve TTP yüzdesini hesaplayın.
Pozitif bir TTP, mikobakteriyel büyümeyi gösterir. Otomatik sıvı kültür cihazı, her 10 dakikada bir karbondioksit seviyelerini izledi ve aşılamadan kültürlerin pozitif olarak işaretlenmesine kadar geçen gün sayısı olan TTP'yi hesapladı. TTP ile başlangıçtaki inokulumdaki CFU'nun log(10) değerleri arasında ters bir ilişki gösterilmiştir.
CFU'nun numaralandırılmasıyla belirlenen makrofajlar içinde Mycobacterium tuberculosis'in hücre içi büyümesi tarif edilen otomatik kültür yöntemi ile karşılaştırıldığında, sonuçlar arasında anlamlı bir korelasyon elde edildi. Mycobacterium tuberculosis büyümesi, makrofajların enfeksiyonundan sonraki sekiz güne kadar TTB değerlerinin başlangıçtaki TTP değeri ile karşılaştırılmasıyla grafiksel olarak sunulmuştur. CFU ve sıvı kültür arasındaki benzer bir eğilim, makrofajlarda Mycobacterium tuberculosis büyümesinin, çözeltideki all-trans retinoik asit veya AtRA varlığında veya PLGA mikropartiküllerinde kapsüllenmiş eşdeğer AtRA dozunda önemli ölçüde inhibisyon gösterdiğini göstermiştir.
Tek başına antibiyotik Linezolid'in etkinliğini veya linezolid ve interferon gama kombinasyonunu belirlemek için enfekte THP-1 hücrelerinde bir doz-yanıt deneyi gerçekleştirildi. İlaçlar arasında anlamlı bir etkileşim gözlenmedi. AFP boyama, makrofajları enfekte ederken hücre ölümünü en aza indirmek ve kullanılan tedaviden bağımsız olarak aynı MOI'nin kullanılmasını sağlamak için düşük bir MOI kullanmamızı sağlar.
Bu protokolü takiben, kurşun anti-TB ilaçlar tanımlanabilir ve in vivo etkinliklerini araştırmak için daha fazla incelenebilir.
