Yama kelepçesi elektrofizyolojisini kullanarak doğal iyon kanalı özelliklerini incelemek, akut olarak izole edilmiş hücrelere erişim gerektirir. Bu protokol, farklı yaşlarda zebra balıklarından bireysel kardiyovasküler miyositlere erişme yöntemlerini açıklar. Bu protokol sağlam, basit, kolayca tekrarlanabilir ve kardiyovasküler miyositleri zebra balıklarından doğal hallerinde nispeten yüksek verim ve canlılık ile izole eder.
Başlamak için, balıkları kısmen perfüzyon tamponu ile doldurulmuş büyük bir Petri kabına aktarın ve diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Balıkları, ventral tarafı diseksiyon kapsamına bakacak şekilde baskın olmayan elinizde tutun. Baskın eldeki ince forsepslerle, atriyum, ventrikül ve bulbus arteriyozus dahil olmak üzere kardiyovasküler dokuları ortaya çıkarmak için balığın pektoral kaslarını ve yüzgeçlerini yavaşça yırtın.
Bulbus arteriyozusu bulbus arteriyozus ve ventral aortun kesişen ucundan yavaşça çekin. Forsepsleri sıkıştırarak bulbus arteriyozusu aorttan dikkatlice ayırın, atriyumun ucunu yakınsayan çoklu venöz dallara yerleştirin. Daha sonra, kardiyovasküler dokuları vücudun geri kalanından izole etmek için atriyumun ucunu sinüs venozusundan ayırın.
Kardiyomiyositleri diseke etmek için, atriyumu ve ventrikülü kardiyovasküler dokudan çıkarın. Fazla kanı boşaltmak için ince forseps kullanarak ventriküle nazik bir yırtılma yapın, bu da kalp dokusu parlak kırmızıdan soluk somon rengine dönüştüğünde sağlanabilir. İzole edilmiş atriyum ve ventrikülü perfüzyon tamponu içeren ayrı bir 1.5 mililitrelik santrifüj tüpünde havuzlayın.
Tüplerdeki perfüzyon tamponunu 750 mikrolitre sindirim tamponu ile değiştirin. Tüpleri bir termoshaker üzerine 37 santigrat derece ve dakikada 800 devirde yerleştirin. Yarı saydam hale gelene kadar dokuların sindirimine izin verin.
Dokuları tezgah üstü bir mini santrifüjde üç ila beş saniye boyunca 2.000 kez G'de yavaşça döndürerek sindirimi sonlandırın ve süpernatant sindirim tamponunu 750 mikrolitre durdurma tamponu ile değiştirin. Durdurma tamponunu nazikçe 500 ila 750 mikrolitre perfüzyon tamponu ile değiştirin ve hücreleri dağıtmak için alevle parlatılmış bir Pasteur pipet kullanarak dokuları 30 kez tritüre edin. Ardından, ventrikülleri yavaşça tritüre edin.
Düzgün örnekleme için, karşılık gelen çalışmalar için bir damla eklemeden önce, hücreleri yeniden askıya almak için birkaç kez yukarı ve aşağı doğru hafifçe pipetleyin. Yetişkin bulbus arteriyozusunu kardiyovasküler dokulardan kesin ve beş bulbus arteriyozusu S1 tamponu içeren 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. S1'i 400 mikrolitre S2 tamponu ile değiştirin ve bulbus arteriyozusun bir termoshaker üzerinde 37 santigrat derecede ve 20 dakika boyunca dakikada 800 devirde papain sindirimine izin verin.
Kısmen sindirilmiş bulbus arteriyozusun bir dakika boyunca yerleşmesine izin verin ve S2 süpernatantını kollajenaz içeren 500 mikrolitre S3 tamponu ile değiştirin. Dokuları bir termoshaker üzerinde 37 santigrat derecede ve üç ila beş dakika boyunca dakikada 800 devirde sindirin. Dokuları tezgah üstü bir minisantrifüjde üç ila beş saniye boyunca 2.000 kez G'de yavaşça döndürerek sindirimi sonlandırın ve S3 süpernatantını 500 mikrolitre S1 ile değiştirin. Vasküler düz kas hücrelerini dağıtmak için peletlenmiş dokuları nazikçe tritüre edin.
Plaka dağılmış vasküler düz kas hücreleri cam kapak üzerine uygun büyüklükte kaymalar. Hücrelerin takılması için kapak fişlerini oda sıcaklığında 30 dakika tutun ve sonraki altı saat içinde kullanın. Embriyoları anestezi altına alır.
Daha sonra, embriyoları beş mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktararak konsantre edin, ardından fazla ortamı çıkarın. Embriyoları üç mililitre soğuk perfüzyon tamponu ile iki kez yıkayın, ardından iki mililitre perfüzyon tamponunda tekrar askıya alın. Embriyonik kalp izolasyon aparatını kullanarak, embriyoların bir mililitresini iğneye çekin ve hemen tüpe geri atın.
Parçalanmış embriyoları bir huni içine yerleştirilmiş 100 mikrometrelik bir hücre süzgeci eleğinden geçirin. Filtrelenmiş kalpleri başka bir beş mililitrelik santrifüj tüpünde toplayın. Filtrat iyice karıştırın ve bir mililitrelik alikotları 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine ayırın.
Tüm tüpleri tezgah üstü bir mini santrifüjde beş saniye boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Bir mililitre perfüzyon tamponu kullanarak tüplerdeki peletlerin seri olarak yeniden süspansiyonunu gerçekleştirin. İlgili çalışmalar için bir damla eklemeden önce kalpleri iki kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyin Bulbus arteriyozustan izole edilen hücreler için, vasküler düz kas hücreleri tagln: EGFP ekspresyonu ile doğrulandı.
İzole kardiyomiyositlerden ATP'ye duyarlı potasyum kanal aktivitesinin kayıtlarının temsili izleri burada gösterilmiştir. Embriyonik kalplerden eksize edilen yamalarda başarılı tek kanallı kayıtlar elde edildi. Ventriküler miyositler stabil hiperpolarize membran potansiyelleri sergiledi ve aksiyon potansiyelleri yama pipeti yoluyla akım enjeksiyonu yoluyla uyarıldı.
Atriyal miyositler spontan aksiyon potansiyeli ateşlemesi sergiledi. Eylem potansiyeli özellikleri burada özetlenmiştir. Kardiyomiyosit ayrışması sırasında tamponlar değiştirilirken, sindirim dokularının bozulmamasına dikkat edilmelidir.
Doku parçalanması sadece pipet tritürasyonu ile yapılmalıdır. Bulbus dokularının kollajenöz sindirimi sırasında, her dakika yüzen, genişlemiş ve yarı saydam dokuları inceleyin. Doku parçalanması belirgin olduğunda, sindirimi durdurun.
Hücreler izole edildikten sonra, saatlerce canlı tutulabilir ve yama kelepçesi teknikleri kullanılarak elektrofizyolojik analiz için kullanılabilir. Bu, örneğin, bu zebra balığı dokularındaki ATP'ye duyarlı potasyum kanallarının esasen memelilerdekilerle aynı olduğunu göstermemize izin verdi.
