Hipokampus ve Prefrontal Kortekste Dendritik Omurga Görselleştirme için Hızlı Golgi Lekesi

Nispeten basit olmasına rağmen, Golgi emprenye tekniğinin bazı zor adımları vardır ve bunları düzgün bir şekilde yapmamak, analiz için uygun olmayan hücrelerle sonuçlanır. Bu teknik, Golgi emprenye edilmiş nöronların hızlı, tekrarlanabilir etiketlenmesini sağlar. Ek olarak, ortalamanın küçük standart hatası, deneyler arasında karşılaştırmaya izin verir.

Bu tekniğin en zorlu kısmı kriyostat bölümlerini kesmektir, çünkü alışılmadık bir tutarlılık ve sabitleme vardır ve bu nedenle bunları slayt düzlüğüne sokmak biraz zordur. İlk olarak, önceden soğutulmuş bir kriyostat mandren üzerine az miktarda doku ortamı yerleştirin. Beyin bloklarını, bloğun bir tarafını eldivenli bir elde hafifçe çözerek ve doku ortamına yerleştirerek kriyostat kıkırdamalarına monte edin.

Bıçağın ve bloğun üzerine dondurucu bir sprey kullanın. Kesim sırasında bölümü düz tutmak için yuvarlanma önleyici plakayı veya fırçayı kullanın. Bir kriyostat üzerinde eksi 22 santigrat derecede 100 mikrometre kesitleri kesin.

Mümkünse, oda sıcaklığında bir slayt kullanarak montaj yapın ve hızlı bir şekilde bölüme ters koyun. Alternatif olarak, slaytları kriyostatta tutun, böylece donarlar. Bölümü soğuk forseps veya soğuk boya fırçası ile aktarın ve ardından montajı çözün.

Sübvansiyonlara üç ila dört koronal bölüm monte edin. Bıçağı dilimler arasında kağıt mendillerle temizleyin. Bıçak daha fazla temizlik gerektiriyorsa,% 100 etanol kullanın ve bir sonraki dilimi kesmeden önce kurutun.

Slaytları, çözeltinin bölümlere erişmesine izin verecek kadar uzağa yerleştirilmiş raflara yerleştirin. Bölümleri 10 dakika boyunca Golgi emprenye çözeltisine yerleştirmeden önce dört dakika boyunca iki kez damıtılmış suya yerleştirin. Bölümlere yalnızca bir kapak kayması yerleştirildiğinden emin olmak için kapak kaymalarını ayırın.

Slaytın üzerine cam kapak kayması yerleştirmeden önce cam slaytları bol miktarda montaj ortamıyla örtün. Kapak kaydıktan sonra, kuru slaytlar gözeneksiz herhangi bir kağıda üç ila beş gün boyunca işaretlenir, özellikle de yapışmayı önlemek için ilk günden sonra hafifçe hareket ettirilir. Daha sonra slaytları slayt tutuculara aktarın ve ideal olarak, incelemeden önce slaytları en az üç hafta kurutun.

Hem medial prefrontal korteksin hem de hipokampusun CA1 bölgesinin piramidal nöronlarındaki dendritik omurga yoğunluğunu analiz etmek için, görüntü analiz programında kullanarak dendritik uzunluğu ölçün. Bir el sayacı kullanarak dendritlerdeki dikenleri sayın ve hem uzunluk hem de diken sayısını kaydedin. Analiz için, emprenye edilirken hücre gövdeleri ve dendritleri olan nöronları ve sürekli ve bitişik hücrelerden ayırt edilebilen dendritleri seçin.

Şekil, hipokampusun CA1 bölgesindeki Golgi emprenye edilmiş hücrelerin örneklerini göstermektedir ve düşük ve yüksek güçte gösterilmiştir. Şekil, CA1 ve medial prefrontal kortekste çevresel zenginleştirmeden sonra ergen erkek ve dişi sıçanlarda piramidal hücreler üzerinde bazal dendritik omurga yoğunluğunun arttırıldığı bir deneyi göstermektedir. Kesim yaparken bölümleri yeterince soğuk tutmak zordur ve bunu yapmak için çok fazla dondurucu sprey kullanıyoruz.

Ve daha sonra, bölümleri slaytlara almak ve düz bir şekilde kurutmak zordur. Bu teknik nöroanatomik özellikleri incelemek için kullanılır. Tek başına veya diğer nöroanatomik izleme yöntemleriyle birlikte kullanılabilir.