Köpek hepatik ve bağırsak organoidlerinin kültürü için protokoller bu yeni teknolojiyi standartlaştırmak için önemlidir. Bu teknik, numunelerin organoid izolasyonu, bakımı, toplanması ve daha sonra biyobankacılığı dahil olmak üzere köpek organoid kültürünün güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde kurulmasını sağlar. Köpek organoidleri, biyoloji, bulaşıcı hastalık geliştirme, ilaç testi ve keşfi ve ayrıca bulaşma tıbbından çok sayıda uygulama için mükemmel bir model sağlayabilir.
Başlamak için, beş mililitre 1X komple şelatlama çözeltisi, üç mililitre 1X komple şelatlama çözeltisine sahip bir tüp, bir boş tüp ve beş mililitre 1X komple şelatlama çözeltisine sahip bir tüp ve iki mililitre fetal sığır serumu içeren beş adet 15 mililitrelik santrifüj tüpü hazırlayın. İzolasyon gününde, biyogüvenlik kabinine steril bir Petri kabı, neşter, buz kovası ve soğuk gelişmiş DMEM besin karışımı F12 yerleştirin. Ön ısıtmak için gerekli sayıda 24 kuyucuklu hücre kültürü plakasını karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.
Çözünür hücre dışı membran matrisini çözülmesi için buz üzerine yerleştirin. Santrifüjü dört santigrat dereceye kadar önceden soğutun. Büyüme faktörlerine sahip tüm ortamları dondurucudan 37 santigrat derecelik bir su banyosuna taşıyın ve doğrudan ışığa maruz kalmaktan kaçının.
Doku örneklerini taşıma tüpünde 30 saniye çalkalayın. Tüpte 0,5 mililitre kalana kadar sıvı yüzeyinin yakınında yavaş pipetleme yaparak herhangi bir dokuyu atmadan aşırı süpernatantı çıkarın. Dokuyu ve kalan süpernatantı steril bir Petri kabına aktarın.
Tek kullanımlık bir neşter kullanarak, dokuyu yaklaşık beş dakika boyunca püre kıvamına benzeyen daha küçük parçalara kesin ve doğrayın. Kıyılmış dokuyu Petri kabından sıvı ile ilk komple şelatlama çözeltisi tüpüne pipetleyin, ardından Petri kabına iki mililitre gelişmiş DMEM besin karışımı F12 ekleyin. Kalan dokuyu yıkayın ve ilk komple şelatlama çözeltisi tüpüne aktarın.
1X komple şelatlama çözeltisi tüpünü beş saniye boyunca yaklaşık beş kez vorteksleyin. Biyopsilerin tüpün dibine bir dakika yerleşmesine izin verin ve beş mililitre kalana kadar süpernatantı çıkarın. 1X komple şelatlama çözeltisini yeni tüpten numune tüpüne aktarın.
Aşağıdaki iki tüp için önceki adımı tekrarlayın. Ve son iki yıkamada, süpernatantı tüpte kalan üç mililitreye kadar çıkarın. Biyopsileri ve 1X komple şelatlama çözeltisini numune tüpünden altı delikli bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın.
Numune tüpüne üç mililitre 1X komple şelatlama çözeltisi ekleyin. Kalan dokuları toplamak ve plakanın aynı kuyusuna aktarmak için yavaşça döndürün. Bir kuyuya 150 mikrolitre 0.5 molar etilen diamin tetraasetik asit ekleyin ve altı kuyucuklu plakayı dört santigrat derecede 20 derece 24 RPM rocker üzerine yerleştirin.
Karaciğer örneklerini 10 dakika boyunca ve bağırsak örneklerini hareketli rocker üzerinde bir saat boyunca inkübe edin. Altı delikli plakayı biyogüvenlik kabinine geri taşıyın ve kıyılmış dokuyu ve sıvıyı fetal sığır serumu ile 1X komple şelatlama çözeltisi içeren bir tüpe aktarın. Dokuların süpernatantı çökelmesine ve dokunun üst kısmının 0.2 mililitresi ile boş bir tüpe taşımasına izin verin.
Numuneyi içeren tüpü 700 XG'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca döndürün. Kök hücreler artık kıyılmış doku ile birlikte peletlenmektedir. Pelet'i rahatsız etmemek için süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
Peletin gelişmiş DMEM F12'de yeniden askıya alınması. Tüpü tekrar döndürün ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin. Hesaplanan çözünür hücre dışı membran matrisi hacmini numune tüpüne ekleyin.
Hücre peletini kaybetmemek için ortamı çıkarırken dikkatli olun. Hücre dışı membran matrisi eklerken, organoid süspansiyonda aşırı kabarcıklar oluşturmamak için yavaşça pipetleyin. Numuneyi çözünür hücre dışı membran matrisi ile buz üzerinde tutun ve süspansiyonu kuyucukların ortasına tohumlayın, böylece çözünürleştirilmiş hücre dışı membran matrisi kubbe benzeri bir yapı oluşturur.
Plakayı bir inkübatöre taşıyın ve çözünür hücre dışı membran matrisinin 30 dakika boyunca katılaşmasına izin verin. ROCK inhibitörü ve GSK3 beta'yı büyüme faktörleriyle birlikte tam ortamda karıştırın ve bu çözeltinin 500 mikrolitresini her bir kuyucuğa ekleyin. Plakayı inkübatöre yerleştirin.
Köpek organoid protokolü tipik olarak kuyu başına yaklaşık 50.000 ila 150.000 bağırsak veya hepatik hücre üretir. Kök hücre izolasyonundan sonra, hepatik köpek organoidleri yaşam döngülerine genişleyen sferoidler olarak başlar ve yedi gün sonra tomurcuklanan ve farklılaşan organoidlere dönüşürler. Sferoidlerin hacmi, yüzey alanı, 2D elips alanı ve çevresi hesaplandı.
Organoid kültürün sağlığını değerlendirmek için 2D elips alanı ve çevresi kullanıldı. Belirteçlerin ekspresyonunun yarı kantitatif bir şekilde değerlendirilmesi, sferoidlerin tercihen kolanjiyosit belirteci KRT7'yi bir ila %26 arasında ifade ettiğini göstermiştirKök hücre belirteci LGR5 ekspresyonu %0,17 ila %0,78 arasında değişirken, hepatosit belirteçleri Forkhead box 1A için %0,05 ila %0,34 ve sitokrom-P450 için %0,03 ila %0,28 arasında daha düşük bir oranda eksprese edilmiştir. Tripsin benzeri proteaz ile 12 dakikalık bir inkübasyon, organoid büyümesini inhibe etmedi.
Bununla birlikte, organoidlerin büyümesi 24 dakikalık bir inkübasyon kullanılarak olumsuz etkilenmiştir. Köpek hepatik organoidlerinin elverişsiz bir ortamda hayatta kalma kabiliyeti, hepatik organoidlerin başarılı büyümesi ve hayatta kalması için gereken organoid ortam ve bodrum matriksinin hacmini belirlemek için analiz edildi. Organoidlerin sağkalım oranı 12.9 gün ile 18 gün arasında değişmekteydi.
Temel hücre kültürü teknikleri ve aseptik yaklaşımlar, uygun organoid izolasyonu ve bakımı için temel ön koşullardır.
