Bu protokol, memeli kraniyofasiyal gelişimi sırasında aktif olan fosfoproteinlerin dinamikleri ve rolleri hakkında daha fazla bilgi edinmek için kullanılabilir. Bu protokol, fizyolojik olarak ilgili iki bağlamdan, fare yüz süreçlerinden ve kültürlenmiş fare embriyonik damak mezenkim hücrelerinden protein izolasyonu sırasında ortak defosforilasyon bariyerinin üstesinden gelir. Tüm reaktifleri ve malzemeleri buz üzerinde tutarken hızlı hareket etmek ve fosforile proteinlerin bütünlüğünü korumak için tüm lizis tamponlarında fosfataz inhibitörleri kullanmak zorunludur.
Başlamak için, fare gövdesini ventral tarafı yukarı bakacak şekilde disseke eden bir tahtaya yerleştirin ve fare karnına% 70 etanol püskürtün. Daha sonra düz Semken forseps ile cildi vajinal açıklığa kadar sıkıştırıp kaldırarak karın boşluğunu açın. Daha sonra, kaldırılan cildi altta yatan katmanlarda düz bıçaklı cerrahi makasla her iki tarafta 45 derecelik bir açıyla kesin ve her bir yanal yüzeye dört uzuv ve arka bacaklar arasında kabaca yarıya kadar uzanan bir V şekli oluşturun.
Semken forsepslerini kullanarak, uterus boynuzlarından birini tutun ve yumurta kanalının altına ve serviksin üstüne cerrahi makasla kesin. Rahim boynuzunun tamamen çıkarılmasına izin vermek için, mezometriyumu kesin, ardından disseke uterus boynuzunu 10 santimetrelik bir Petri kabında 10 mililitre histoloji PBS'ye aktarın. Benzer şekilde, karın boşluğunun karşı tarafındaki ikinci uterus boynuzunu çıkarın.
Daha sonra, her iki uterus boynuzunu içeren 10 santimetrelik Petri kabını buzun üzerine yerleştirin. Diseksiyon stereo mikroskop altında, her embriyoyu uterus boynuzlarından Dumont 5 ince forseps ile dikkatlice diseke edin. Sonra yavaşça miyometriyum, decidua ve koryonu çekin.
Daha sonra, embriyoyu çevreleyen nispeten şeffaf amniyonun yırtılıp çıkarılması ve embriyonun plasentaya bağlanması göbek kordonunun kesilmesi. Daha sonra, disseke edilmiş her embriyoyu, kesilmiş bir plastik transfer pipeti kullanarak buz üzerinde 12 delikli bir hücre kültürü plakasının ayrı bir kuyucuğunda 2.5 mililitre histoloji PBS'ye aktarın. 10 mililitre histoloji PBS içeren üç adet 10 santimetre Petri kabı hazırlayın ve embriyolar arasında rotasyonda kullanılmak üzere buz üzerinde tutun.
Daha sonra bir embriyoyu, 12 delikli hücre kültürü plakasının bireysel bir kuyucuğundan, kesilmiş bir plastik transfer pipeti kullanarak buz üzerinde histoloji PBS'li 10 santimetrelik Petri kaplarından birine aktarın. Diseksiyon mikroskobu altında, önce maksiller süreçte lateral burun sürecini ayıran doğal girinti boyunca bir maksiller işlemin ön tarafında bir kesim yaparak ince forseps kullanarak her maksiller işlemi yüzden ayırın. Daha sonra, maksiller sürecin arka tarafını, maksiller süreci ve mandibuler süreci ayıran doğal girinti boyunca kesin.
Daha sonra, maksiller işlemin göz tarafında, maksiller işlemin ön taraflarından arka taraflarına, yukarıda atıfta bulunulan doğal girintilerin bittiği yerde dikey bir kesim yaparak maksiller süreci tamamen ayırın. İki mililitrelik küçük lateks ampullü dokuz inçlik bir Pasteur pipet kullanarak, disseke edilmiş maksiller işlem çiftini, yaklaşık 30 mikrolitre histoloji PBS'den oluşan küçük bir damlacıkta, buz üzerinde etiketli 35 milimetrelik Petri kabına aktarın. Daha sonra maksiller proses dokuları çiftini, Pasteur pipeti kullanarak buz üzerinde etiketli 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpe aktarın ve histoloji PBS'nin transferini en aza indirin.
Ayrıca, 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpündeki fazla histoloji PBS'sini Pasteur pipetle birlikte çıkarın. Buz üzerinde kullanılmadan hemen önce eklenen proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile 0.1 mililitre buz gibi soğuk NP40 lizis tamponu ekleyin. Daha sonra 200 mikrolitrelik PIPETMAN ile 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
Daha sonra, 10 saniye boyunca vorteks yapın ve ardından kabarcıkların oluşmasını önlerken 200 mikrolitrelik bir PIPETMAN ile 10 kez yukarı ve aşağı pipet yapın. Bir tüp tabanca ile 1,5 mililitre veya iki mililitrelik bir kürek kullanarak uçtan uca dönerken, iki saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra numuneleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 13.500 x g'de santrifüj edin ve süpernatantı 200 mililitrelik bir PIPETMAN ile buz üzerinde yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne toplayın.
İlk olarak, bir vakum sistemine bağlı 5.75 inçlik bir Pasteur pipet kullanarak ortamı fare embriyonik damak mezenkimi hücrelerinden aspire edin. Daha sonra hücreleri buz gibi soğuk doku kültürü PBS ile iki kez yıkayın ve tüm doku kültürü PBS'nin aspire edildiğinden emin olmak için son yıkama sırasında plakayı yana doğru eğin. Daha sonra, hücreleri lize etmek için buz üzerinde kullanılmadan hemen önce eklenen proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile buz gibi soğuk NP40 lizis tamponu ekleyin.
Plakanın tam olarak kaplanmasını sağlamak için plakayı beş dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin ve yaklaşık olarak her dakika döndürün. Ardından, önceden soğutulmuş bir hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri plakadan kazıyın ve hücre süspansiyonunu buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, hücre süspansiyonunu 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe ederken, bir tüp tabanca ile 1.5 mililitre veya iki mililitrelik bir kürek kullanarak uçtan uca döndürün.
Daha sonra numuneleri dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 13.500 x g'de santrifüj edin ve süpernatantı 200 mililitrelik bir PIPETMAN ile buz üzerinde yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne toplayın. PDFG-B ligandı ile 2 ila 15 dakika arasında uyarılmasını takiben ölümsüzleştirilmiş fare embriyonik damak mezenkimi hücrelerinden tüm hücre lizatlarının batı lekesi analizi, karşılık gelen toplam protein bandının yüksekliğinde veya yakınında çalışan fosfoproteinler için farklı tekrarlanabilir bantlar ortaya koymuştur. Tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla bir büyüme faktörü ile tedavi edildiğinde fosfoprotein bant yoğunluklarında bir artış gözlenirken, toplam protein bant yoğunlukları numuneler arasında nispeten eşitti.
Bu protokol, pertürbasyonların ve fosforilasyonun hücreler arası sinyalleşmeyi, gen ekspresyonunu ve kraniyofasiyal bağlamlardaki hücresel aktiviteyi doğrudan nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılabilir.
