Trifosforilasyon, biyolojide RNA'nın her yerde bulunan 5' modifikasyonudur ve biyoteknoloji uygulamalarında giderek daha fazla kullanılmaktadır. Burada özetlenen protokol, standart otomatik sentez ile hazırlanan herhangi bir oligonükleotidin 5'trifosforilasyonunu sağlar. Kimyasal trifosforilasyon, RNA, DNA veya doğal olmayan nükleik asit içeren oligonükleotidler üzerinde çalışır.
Burada, biyolojik D-RNA'nın enantiyomeri olan trifosforile solak L-RNA, saflaştırılmış olarak sentezlenir ve bir ribozom reaksiyonunda kullanılır. Trifosforilasyon, otomatik oligonükleotid sentezinden sonra ve deproteksiyondan önce gerçekleştirilir. Bu adımlar burada gösterilmemiştir, ancak araştırmacılar her ikisi için de standart yöntemlere aşina olmalıdır.
Başlamak için, fosforilasyon çalışma alanının en az iki hatlı bir gaz manifolduna sahip olduğundan ve trifosforilasyon reaksiyonu argon altında gerçekleştirilmesi gerektiğinden, kabarcığın ayarlanabilir basınçla kuru bir argon kaynağına bağlandığından emin olun. Ardından, reaksiyon aparatına bağlantıyı kolaylaştırmak için hatlara bir mililitre plastik şırınga takın. Daha sonra, bir mililitrelik plastik şırıngalar, üç bir polipropilen tıpa, noncoring iğneler, 1,5 mililitre polipropilen tüpler, küçük bir metal spatula dahil olmak üzere ekipmanı toplayın ve kullanımdan en az bir gün önce oda sıcaklığında bir kurutucu ile kapalı bir kapta veya kurutucuda saklayın.
Argon basıncı altında, kapalı bir şişeden 30 mililitre susuz 1, 4-dioksan çekin. Kurutulmuş 30 mililitrelik bir cam şişeye aktarın ve bir kurutma tuzağı ekleyin. Kauçuk septa ile kapatın ve kurutuculu bir kurutucuda saklayın.
Benzer şekilde, 30 mililitre N, N-dimetilformamid, asetonitril ve üç parça dioksan ve bir parça piridin karışımını hacimce hazırlayın. Makalede açıklandığı gibi 30 mililitrelik bir cam şişede katı tributylammonium pirofosfatı dimetilformamid ve tributilamin ile karıştırarak TBAP çözeltisi hazırlayın. Üç çizim tuzağı ekleyin.
Şişeyi argon altında kauçuk bir septumla kapatın ve 30 dakika boyunca argon ile kabarcıklayın. Otomatik bir DNA / RNA sentezleyici kullanarak bir sentez sütunu üzerinde serbest bir 5'hidroksil ile bir oligonükleotid hazırladıktan sonra. Pistonu kuru bir mililitrelik şırıngadan çıkararak odayı hazırlayın.
Şırınganın üstünü makas veya tıraş bıçağı kullanarak kesin ve şırıngayı sentez kolonuna takın. Şırınganın tepesine, üç yönlü stopcock'u takın ve stopcock'un yan girişini bubbler ile kuru argon kaynağına takın, böylece stopcock'un üst girişi reaktif enjeksiyon portu olarak işlev görür. Bu operatörü kelepçeli bir standa sabitleyin ve tüm yukarı akış bağlantılarını balmumu sızdırmazlık filmi ile kapatın.
Ardından, enjeksiyon portu kapalı olacak ve aparat argon kaynağına açık olacak şekilde stopcock'u ayarlayın. Kabarcığı kapatın ve düşük basınçta argon'un beş dakika boyunca eylem odasından akmasına izin verin. Kabarcığı yeniden açtıktan sonra, atık şırınga olacak sentez sütununun dibine bir şırınga takın.
Daha sonra, atık şırıngayı kullanarak argonu sütundan tekrar tekrar çekin ve ardından şırıngayı piston tamamen içeri itilerek tekrar takın. Bir reaktif veya çözücü eklemek için, kuru argon kaynağına bir iğne takın ve iğneyi şişe içeriğine batırmamaya dikkat ederek reaktif veya çözücü şişe septumuna yerleştirin. Daha sonra kuru bir şırıngayı bir iğne ile birleştirin ve şişe içeriğine batırmadan reaktif veya çözücü şişe septumuna yerleştirin.
Daha sonra, şırıngayı argon ile doldurun, iğneyi septumdan çekin ve argonu dışarı atın. Şırıngayı argon ile doldurduktan ve bir kez daha dışarı attıktan sonra, şırıngayı argon basıncı altında gerekli miktarda çözücü veya reaktif ile doldurun. Stopcock'u, argon kaynağı kapalı ve enjeksiyon portu açık olacak şekilde ayarlayın.
Aparat üzerindeki durdurma hızlı bir şekilde ayarlandıktan sonra, doldurulmuş şırıngayı ve iğneyi kaynak şişeden çıkarın, iğnenin yanına veya ucuna yapışmış çözücüleri silin ve ardından iğneyi enjeksiyon portuna yerleştirin. Bir reaktifi operatörlerin anti-odasına attıktan sonra, iğneyi çıkarın ve aparatı argon kaynağına yeniden açarken enjeksiyon portunu kapatın. Atık şırıngayı kullanarak sıvıyı anti-odacıktan sentez sütunu boyunca yavaşça çekin, böylece tüm sıvı artık atık şırıngada tutulur.
Şimdi çözeltiyi yavaşça sentez sütununa geri iterek sütunda gaz kabarcığı olmadığından emin olun. Karıştırmak veya çalkalamak için, çözeltiyi atık şırınga ile sütunun üzerinde yavaşça yukarı ve aşağı çekin. Bir reaktifi veya çözücüyü kolondan çıkarmak için, çözeltiyi yavaşça atık şırıngaya çekin.
Çözeltinin büyük kısmı atık şırıngaya geçtikten sonra, kalan çözücüyü kolondan temizlemek için argon'u çekin. Ardından, atık şırınga ekleminin etrafındaki balmumu sızdırmazlık filmini çıkarın. Ardından şırıngayı çıkarın ve atık çözeltisini atın.
Daha sonra, atık şırıngayı yeni bir kuru şırınga ile değiştirin ve eklemi yeniden kapatın. Trifosforilasyon aparatını monte ettikten sonra, daha önce gösterildiği gibi anti-odaya 200 mikrolitre piridin dioksan ekleyerek trifosforilasyon reaksiyonuna başlayın. Ancak numuneyi henüz sentez kolonuna çekmeyin.
SalPCl'yi makalede açıklandığı gibi dioksan içinde çözdükten sonra, anti-odaya ekleyin ve kuru bir şırınga kullanarak sentez kolonuna yükleyin. Daha sonra 15 dakika boyunca reaksiyona girmesine izin verin ve daha sonra daha önce gösterildiği gibi bir atık şırınga kullanarak SalPCl çözeltisini çıkarın ve atın. SalPCl çözeltisini çıkardıktan hemen sonra, anti-odaya 250 mikrolitre TBAP çözeltisi ekleyin ve sentez kolonuna yükleyin.
20 dakika ajitasyonla tepki vermesine izin verin ve daha önce açıklandığı gibi atın. Daha sonra, kolonu 0.5 mililitre N, N-dimetilformamid, daha sonra 0.5 mililitre asetonitril ile yıkayarak her eklemeden sonra çözücüyü çıkardı. Oksitleyici çözeltisi ekledikten sonra, çıkarıldıktan ve gösterilen aynı prosedürü kullanarak kolonu tekrar asetonitril ile yıkadıktan sonra, aparatı sökün ve kolonu beş mililitre asetonitril ile yıkayın.
Daha sonra sütunu kurutun. Trifosforile oligonükleotidi katı destekten ayırın ve makalede açıklandığı gibi standart protokolleri kullanarak korumayı ortadan kaldırın. Daha sonra, kurutulmuş korumasız oligonükleotidi üre yükleme tamponunda çözdü, 80 santigrat dereceye ısıtıldı, daha sonra bir poliakrilamid jel üzerine yüklendi ve 25 ila 35 watt'ta bir ila iki saat çalıştırıldı.
Jel elektroforezinin sonunda, jel plakasını çıkardıktan sonra, sökün ve jeli polivinilklorür filmine sarın. Ardından, 254 nanometre UV ışığı ile arka gölgeleme yaparak ürün bantlarını tanımlayın ve bir tıraş bıçağı kullanarak ana ürün bandını çıkarın. Eksize edilmiş jeli plastik bir şırıngadan veya mekanik olarak ekstrüzyon yaparak ezin.
15 nükleotidden daha kısa oligonükleotidler için, nükleaz içermeyen suyun jel hacminin üç katını ajitasyon veya sallama ile en az 12 saat boyunca süzün. Daha sonra çözeltiyi 0.2 mikrometre filtre ile donatılmış bir şırıngadan geçirerek katı jel parçalarını çıkarın ve liyofilizasyon ile konsantre edin. Konsantrasyonu takiben, artık tuzları ve selamları tek kullanımlık bir boyut dışlama sütunu kullanarak çıkarın ve daha önce gösterildiği gibi liyofilizasyon ile konsantre edin.
Makalede açıklandığı gibi polimeraz ribozim ve L-RNA primer şablonu ve trifosfat trinükleotidleri içeren bir RNA çözeltisinin 10 mikrolitresini hazırladıktan sonra, bir dakika boyunca 90 santigrat dereceye ısıtarak ve bir PCR termosiklusunda saniyede 0.2 santigrat derecede 23 santigrat dereceye soğutarak tavlayın. RNA çözeltisini 17 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, reaksiyon ilerledikçe başlangıç tamponunun konsantrasyonunun iki katı 10 mikrolitre ekleyerek reaksiyonu durdurun, 10 mikrolitre alikot alın ve pH 8'de beş mikrolitre 0.5 molar EDTA ile söndürün ve her numuneyi RNA'yı makalede açıklandığı gibi izole etmek için işleyin. Çökeltilmiş RNA'yı 10 mikrolitre formalize jel yükleme tamponunda çözün ve metinde açıklandığı gibi reaksiyona girmemiş son etiketli astar hazırlayın.
Numuneler hazırlandıktan sonra, 80 santigrat dereceye ısıtın. Her bir kuyucuğa numunenin beş mikrolitresini yükleyin ve jeli yaklaşık 40 dakika boyunca 40 watt'ta çalıştırın. Jel plakasını standdan çıkardıktan sonra, çapraz kiral L-RNA uzatma ürünlerini görselleştirmek için bir floresan veya fosforesan jel tarayıcı kullanarak tarayın.
Jel saflaştırmadan sonra, UV arka gölgeleme, AAA ve CCC DNA düzelticiler ve GAA L-RNA trimeri için gösterildiği gibi tek bir ana ürün olarak 5'trifosfatın varlığını ortaya koymaktadır. 5'hidroksil yan ürün genellikle DNA düzelticiler için kütle spektrometrisi ile izole edilen ve tanımlanan daha yavaş bir göç bandı olarak görülebilir. Jel saflaştırma sırasındaki ek bantlar, saflaştırılmamış reaksiyon ürünlerinin kütle spektrometrisinde 5'difosfat, monofosfat ve H-fosfonat yan ürünleri ile ilişkilidir.
5'trifosfat ürünleri, 5'di ve monofosfat kütleleri ile birlikte 5'trifosfata karşılık gelen birincil kütle zirvesini gösterir. Kimyasal olarak trifosfatla ilişkili L-RNA trinükleotidleri, PAGE tarafından analiz edilen ve bir floresan jel tarayıcı kullanılarak görüntülenen bir RNA polimerizasyon reaksiyonunda bir L-RNA primer ve L-RNA şablonu ile kullanıldı. Siyah dairelerle işaretlenmiş genişletilmiş ürün, şablon tarafından kodlanan çekiç kafalı ribozimin L-RNA versiyonunun sentezini gösterdi.
Trifosforilasyon sırasında suya maruz kalmak verimi azaltacaktır. Kuru reaktifleri hazırlamak ve reaksiyon aparatını dikkatlice monte etmek için adımları izleyin. Contaların kırılmasını önlemek için sıvıları aparattan yavaşça hareket ettirin.
Kimyasal trifosforilasyon, solak RNA da dahil olmak üzere biyolojik olmayan oligonükleotid trifosfatların hazırlanması için gereklidir. Bu, biyolojide bulunan RNA moleküllerinin ayna görüntüsü versiyonlarının çapraz kiral ribozim sentezini sağlamıştır.
