Bu protokol, ilk kez enterik sinir sisteminden hücreler üzerinde bir bakteri türü etkisinin incelenmesine izin verdiği için önemlidir. Enterik sinir sistemine kolayca erişilemediğinden, bu model bağırsak mikrobiyomunun enterik sinir sisteminden hücreler üzerindeki etkisini incelemeye izin verir. Gelecekte, bu model, hastalıklı hastaların bağırsak mikrobiyomunun, örneğin Parkinson Hastalığında, enterik sinir sistemindeki hücreleri nasıl etkilediğini görmek için kullanılabilir.
Gelecekteki olası bir amaç, bağırsak-beyin eksenini temsil eden bir model oluşturmak için bu modeli diğer çip üzerindeki organ modellerine bağlamak olacaktır. Protokol birçok adım içerdiğinden ve her adım bu modelin başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesi için çok önemli olduğundan, bu tekniğin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu prosedürü göstermek, Sistem Ekolojisi Laboratuvarı'ndan doktora adayı Catherine Sedrani olacaktır.
Başlamak için, kelepçenin üst ve alt kısımlarını sabitleyerek vidaları sıkın ve kapağın köşesindeki dört vidayı tutarak kaplanmış ve kurutulmuş alt polikarbonat kapağı kare Petri kabından kelepçe tabanının üstüne aktarın. Epitel haznesi contasını, membran polikarbonat kapağın üzerine bakacak şekilde konumlandırmak için steril cımbız kullanın. Contayı ve kapağı vidalarla hizalayın, köşe giriş ve çıkış portlarının conta açıklıklarıyla hizalandığından emin olun.
Sandviç contayı, üst tarafı yukarı bakacak şekilde kollajen contanın üzerine yerleştirin. Ardından üst polikarbonat kapağı sandviç contanın üzerine yerleştirin. cl üzerindeki dikenleramp kapak, membran tertibatlarının giriş ve çıkış açıklığı ile aynı hizadadır ve alt kapak vidalarının üst kapağın açıklığına oturduğundan emin olun.
Cihazı kapatmak için, kelepçe kapağını polikarbonat kapağın üstüne yerleştirin ve mandalları kapatın. Boru hatlarının astarlanması için, filtreli havalandırma iğnelerini her bir giriş ve çıkış şişesinin septumuna yerleştirin. Temiz steril cımbız kullanarak 120 milimetrelik iğneleri 250 milimetrelik serum şişelerine ve 80 milimetrelik iğneleri 15 milimetrelik serum şişelerine yerleştirin.
Her boru hattının ucundaki 40 milimetrelik iğneleri bir çıkış serum şişesine yerleştirin. Epitelyal ve nöronal boru hatlarının 40 milimetrelik iğneleri, orta atma için aynı çıkış şişesine bağlanır. Bakteri tüpü hattı ikinci çıkış şişesine gider.
Pompa boru hatlarını pompa kasetlerine yerleştirin. Peristaltik pompayı, ortamı girişten çıkış şişesine beş RPM hızında yönlendirecek şekilde ayarlayın ve pompayı çalıştırmak için başlat düğmesine basın. Boru hatlarının üç vanalarının hepsinin açık olduğundan emin olun.
Ortam çıkış şişelerine düştüğünde, boru hatlarında ve bağlantı noktalarında sızıntı veya hava kabarcığı olmadığından emin olun. Tüm tüp hatları çıkış şişelerine düştüğünde, ilk cihazı bağlamak için akış hızını iki RPM'ye ayarlayın. Bir hattı bağlamak için, çıkış tarafından başlayarak üç vanaları kapatın.
Kısa boruyu dişi yem konektöründen ayırın ve boruyu diken üzerinden iterek cihazın çıkış portuna takın. Güvenli, sızdırmaz bir bağlantı için, boruyu konektörün üzerinden sonuna kadar itin ve kapağa temas ettiğinden emin olun. Bir hat cihaza tamamen bağlandığında musluğu açın.
Basınç oluşumundan kaynaklanan sızıntıları önlemek için pompanın akış hızını iki RPM'ye ayarlayın ve pompa hızını maksimum 2,5 RPM'ye yükseltin. Pompanın odaları doldurmasına izin verin. Tüm bölmeler hücre kültürü ortamıyla doldurulduğunda ve cihazda kabarcık kalmadığında pompa hızını 0,5 RPM'ye düşürün.
Epitel hücreleri için, tripsin EDTA kullanarak Caco-2 hücrelerini şişeden ayırın. Bunları RPMI 1640 artı %10 FBS'de yeniden süspanse edin ve tripan mavisi dışlama testini kullanarak bir Neubauer hücre sayacında sayın. Caco-2 hücre süspansiyonunu 300G'de üç dakika santrifüjleyin ve EDTA'da kalan gezileri gidermek için süpernatanı atın.
Mililitre başına 0.35 milyon hücrelik bir süspansiyon elde etmek için Caco-2 hücrelerini RPMI 1640 artı% 10 FBS'de yeniden süspanse edin. 1.5 mililitre Caco-2 hücre süspansiyonunu iki mililitrelik steril bir şırıngaya aktarın ve şırıngada kalan hava kabarcıklarını çıkarın. Hem bakteri hem de nöronal odaların hortumundaki üç vanaları kapatın ve ilgili borulu kasetleri rotordan çıkararak boruyu pompadan ayırın.
Epitel odasına giden giriş borusunun vanasının kapağını açın ve orta akışı cihazdan açık konektöre yönlendirmek için vanayı çevirin. Stop vanasının açık ucunda bir damla ortam görünene kadar ortamın akmasına izin verin. Yerleştirme sırasında hava kabarcığı girmesini önlemek için damla-damla bağlantı yöntemini kullanarak epitel hücreli şırıngayı açık konektöre yerleştirin.
Ortamın giriş şişesinden akışını durdurmak ve bağlı şırıngadan ilk cihaza akışa izin vermek için vananın valfini çevirin. Epitel odasını pompadan ayırın ve epitel odasını 1.5 mililitre hücre süspansiyonu ile aşılamak için şırıngaya yavaşça bastırın. Çıkış vanasının valfini kapatın ve şırıngayı ayırın.
Musluğun açık ucunu kapakla kapatın ve hazneyi en az iki saat kapalı tutun. Bu arada, nöronal hücreleri aşılayın. Cihazı inkübatörden çıkardıktan ve boru hatlarını çıkardıktan sonra, kelepçeyi yavaşça açın ve kapağı çıkarın.
Üst polikarbonat kapağı dikkatli bir şekilde çıkarın. Ortamı 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde toplayın ve buzun üzerine yerleştirin. Ortamı hücre katmanına dokunmadan epitel odasından toplarken sandviç contayı yavaşça çıkarın.
Sandviç contayı kare bir Petri kabına yerleştirin ve hazne tamamen kaplanana kadar bakteri haznesine steril% 0.9 sodyum klorür ve su çözeltisi ekleyin. Ortamı nöronal odadan toplarken kollajen contayı yavaşça çıkarın. Ortamı bir mikro santrifüj tüpüne aktardıktan sonra, tüpleri buzun üzerine yerleştirin.
Kollajen contayı kare bir tabağa yerleştirin ve hücre tabakası tamamen kaplanana kadar Caco-2 tabakasına birkaç mililitre PBS ekleyin. Alt polikarbonat kapağı kare bir Petri kabına yerleştirin ve örnekleme işlemi sırasında kurumaması için nöronal hücrelerin üzerine yaklaşık iki mililitre PBS ekleyin. Medya tüpünü dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin.
Her tüpün süpernatantlarını yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktardıktan sonra hemen kuru buz üzerine yerleştirin. CFU sayısı, iki farklı ilk cihaz kurulumu için değerlendirildi. L. reuteri, insan mikrobiyal karışma cihazında Caco-2 ve L. reuteri ile birlikte kültürlendi.
Her iki kurulumda da, CFU sayımları, HuMix aşısından ve ilk cihaz içindeki bakteri hücrelerinin büyümesini gösteren hasat edilen hücrelerden önemli ölçüde farklıydı. Cihazdaki enterik nöronların kültürlenmesinin hücre fenotipini değiştirip değiştirmediğini değerlendirmek için, kaba morfolojileri ters faz kontrast mikroskobu kullanılarak gözlemlendi. Birleşen bir nöronal ağın kurulması, hücrelerin kaplanmış cihazların polikarbonat kapağına iyi bir şekilde bağlandığını gösterdi.
Birleşen nöronal ağ ile conta ile tanımlanmış spiral arasındaki kenar açıkça görülüyordu. Nöro hümiklerin potansiyeli, temsili bir modelin olmaması nedeniyle insan-bağırsak mikrobiyomu ve enterik sinir sistemi arasındaki etkileşimlerle ilgili olarak daha önce ele alınması zor olan soruları yanıtlamakta yatmaktadır.
