Bu protokol, eritrosit sedimantasyon hızı ölçümlerini en son fiziksel modelle hizalar ve testin daha sağlam bir analizini sağlar. Bu protokol, eritrosit sedimantasyon hızının daha doğru ve sistematik bir şekilde kullanılmasını sağlar, ancak aynı zamanda geleneksel değerleri de sağlar. Daha önce bu tekniğin özellikle düşük eritrosit sedimantasyon hızı değeri gösteren bozukluklar için geçerli olduğunu göstermiştik.
Nöroakantositoz sendromları için tanısal taramalar için kullanılabilir. Başlamak için, kanı standart 9 mililitrelik EDTA tüplerinde ve serumu standart 9 mililitrelik serum tüplerinde toplayın. Paketlenmiş eritrositlerin optimal sıkıştırılması için, kan örneklerini en az yedi dakika boyunca 3.000 g'da santrifüj edin ve süpernatanı aspire edin.
Şimdi belirlenen oranlarda otolog plazma ve serum karışımları hazırlayın. Örneğin,% 25 ila% 75 plazma serum karışımının 2.5 mililitresini hazırlarken, 1.875 mililitre seruma 0.625 mililitre plazma ekleyin. Peletleri PBS'de veya istenen askıya alma sıvısında tekrar askıya alın ve süpernatantı yıkamak için dahil ettikten sonra hafifçe karıştırın.
Üç kez tekrarlayın ve son yıkamayı istediğiniz askıya alma sıvısıyla yapın. Gerekli paketlenmiş hücre hacmini ayıklayın. Paketlenmiş hücreleri,% 45'lik bir hematokritte 4 mililitrelik bir numune için yüksek viskoziteli bir sıvı olarak işleyin, plazma serum karışımının veya istenen başka bir sıvının 2.2 mililitresi içinde 1.8 mililitre paketlenmiş hücreyi askıya alın.
Hematokrit tayini için gerekli miktarda numuneyi çıkarmak için, alt ucunu sıvıya batırarak mikrohematokrit kılcal damarlarını oluşturun. Tüpte kılcal emme ile gerekli miktarda numune yükseldiğinde, akışı durdurmak için açıklığı kapatın. Daha sonra, kılcal damarları sızdırmazlık balmumu ile kapatın, mikrohematokrit santrifüjüne yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre beş dakika boyunca 15.000 g'da çalıştırın.
Kılcal damardaki hematokrit seviyesini okuyun ve referans için yazın. Şimdi, numunenin çökelmesini kaydetmek için, tutucunun önüne, ESR tüplerinin dinlenme halinde bırakılacağı sabit bir kamera kurun ve daha iyi kontrast için beyaz, aydınlatılmış bir arka plan kullanın. İşaretsiz boş Westergren tüplerini kullanarak, numunelerin yerleştirileceği en yüksek çözünürlüğü elde etmek için kameranın odağını ve görüş alanını ayarlayın.
Resimlerin kenarlıklarının dikey ve yatay yönlerde hizalandığından emin olun. Ardından, piksel çözünürlüğünü çıkarmak için ölçeklendirilmiş bir tüpün resmini çekin. Fotoğraf makinesinin ışığını ve pozlama süresini beyaz bir arka plana sahip olacak ancak doygunluk olmayacak şekilde ayarlayın.
Westergren tüpünün alt kabını, üreticinin talimatlarına karşılık gelen numunelerin hacmiyle doldurun ve üretici tarafından belirtildiği gibi alt kaba yerleştirin. İlk tüp hazır olduğunda, tutucuya yerleştirin ve kamera kaydını başlatın. Her dakika bir resim kaydetmek genellikle ESR kinetik eğrisinin iyi bir çözünürlüğünü verir.
Sonraki örnekleri hazırlayın ve yerleştirin. Fotoğraf çekilirken herhangi bir numunenin önünde durmadığınızdan emin olun. Kayıttan sonra, MATLAB kodunu kullanarak ESR eğrisini çıkarmak için, eritrosit hücresiz plazma arayüzünün en düşük konumunun altında ancak numune içinde bulunan parçanın yalnızca bir tüpün görünür olduğu bir ilgi alanı seçin.
X, Y, W ve H değerlerini not edin ve bu değerleri MATLAB komut dosyasında kullanın. RGB resminin ilgilendiği bölgeyi gri tonlamalı bir resme veya matrise dönüştürün. Genellikle, üç renk kanalını birleştirmek net bir arka planla çok verimlidir.
Ardından resmi ikili hale getirin. Sağlıklı bir numune için, ARC2 eşiğini kullanmak genellikle tutarlı bir sonuç verir. Yüksek hematokritli veya bazı hemolizli numuneler için, tüp içindeki çeşitli fazlar arasında elde edilen tam kontrasta bağlı olarak manuel olarak ayarlamak veya başka bir otomatik yöntem kullanmak daha iyi olabilir.
Yatay yön boyunca GR'nin piksel değerlerinin ortalamasını elde edin. Bu adım gürültüyü en aza indirir ve olası arayüz düzensizliklerinin ortalamasını verimli bir şekilde alır. Varyasyonları hesaplamadan önce, özellikle tüpler bazı yatay işaretler içeriyorsa, eğriyi hareketli bir ortalamayla düzleştirin.
Ardından, arayüz konumunu en yüksek yoğunluk değişimine sahip nokta olarak tanımlayın ve her resim ve her örnek için tekrarlayın. Her örnek için, arabirimin zaman içindeki konumlarını fiziksel modele uyacak şekilde uygun bir biçimde kaydetmek için uygun bir yazılım kullanın. Uygun şekilde uyan herhangi bir yazılımı kullanarak, hematokriti ve kan kolonunun başlangıç yüksekliğini bilerek, gecikme süresinin, boyutsuz zamanın ve eritrositlerin son paketlenmiş hacim fraksiyonunun değerlerini bulun, bu da fiziksel model için kare kalıntı sapmaların toplamını en aza indirir.
Kantitatif eğri resimden çıkarıldıktan sonra, numunenin fiziksel parametrelerini kaydedin. 30 dakika, bir saat veya iki saatteki geleneksel ESR değerleri, referans için eğriden çıkarılabilir. Sedimantasyon hızı, hematokrit veya başlangıç hacim fraksiyonlarının artmasıyla azalır.
Fibrinojen konsantrasyonu azaldığında eritrositlerin sedimantasyonu yavaşlar. Ekstrakte edilen maksimum sedimantasyon hızının numune hematokritinin bir fonksiyonu olarak değişimi ve boyutsuz zaman için elde edilen değerler, eritrositin son paketlenmiş hacim fraksiyonu ve gecikme süresi gösterilmiştir. Düzeltmenin, başlangıçtaki hematokritin yanı sıra veri dağılımının çoğuna olan genel bağımlılığı ortadan kaldırdığı görülebilir.
Çeşitli fibrinojen konsantrasyonları için ekstrakte edilen parametrelerin karakteristik değerleri gösterilmiştir. Sedimantasyon işleminin başlangıcındaki ilk çökeltme hızı, fibrinojen konsantrasyonundaki bir artışla artar. Sedimantasyonun boyutsuz karakteristik süresi, fibrinojen konsantrasyonunun artmasıyla azalır.
Sedimantlı eritrositlerin son hacim fraksiyonu fibrinojen konsantrasyonundan neredeyse bağımsızdır. Gecikme süresi, fibrinojen konsantrasyonunun artmasıyla azalır, bu da daha güçlü çekici etkileşimlerin, sıvı kanallarının kurulmasına yol açan ilk eritrosit yapılarının yeniden düzenlenmesini hızlandırdığını gösterir. Görüntü yakalama ile ilgili kritik noktalardan biri, tek tip parlak bir arka plana sahip olmaktır, değil mi?
Tüplerin etrafında belirgin gölgelerden kaçının. Bu teknik, orak hücreli anemi veya kronik dağ hastalığı gibi düşük eritrosit sedimantasyon hızı ile ilişkili diğer hastalıkların karakterizasyonu için kullanılabilir.
