Biyokimyasal biyobelirteçleri değerlendirme teknikleri yaygın olarak kullanılsa da, bu protokol neotropik anuranlarda metodolojiyi standartlaştırmak ve çoğaltmak için çok önemli ayrıntılar sunmaktadır. Bu tekniğin temel avantajı, düşük maliyeti, tekrarlanabilirliği ve uygulamasıdır. Bu teknik, iç melanindeki değişiklikleri değerlendirmek için kantitatif veriler elde etmek için uygulanabilir.
Kuyruklu yıldız testi, belirli bir bileşiğin neden olduğu genotoksik etkilerin belirlenmesine izin veren hassas, çok yönlü ve basit bir tekniktir. DNA hasarını, DNA onarımını izlemek ve hücrelerin antioksidan durumunu değerlendirmek için her türlü ökaryotik hücreye uygulanabilir. Başlamak için Image-Pro Plus 6.0 yazılımını açın ve menü ve araç çubuğunu biyolojik olarak seçin.
Melaninin kapladığı alanı ölçmek için Ölç'ü seçin, ardından fotoğraf mikrograflarını çekmek için kullanılan büyütmenin uzamsal kalibrasyonunu seçin. Histolojik görüntüyü açtıktan sonra, takım sayısını seçin ve ardından nesneleri ölçün. Renkleri ve damlalık seçme aracını kullanarak görüntüde ölçülecek rengi işaretleyin ve ardından pencereyi kapatın.
Sayım, görünüm ve istatistiklere tıklayarak sonuçları görselleştirin. PBS, hidrojen peroksit ve bir numune karışımını, bir santimetre yol uzunluğuna sahip üç mililitrelik bir kuvars küvette inkübe edin. Daha sonra 500 mikrolitrelik bir santrifüj tüpünde tutulan numuneyi çıkarın ve kuvars küvete ekleyin.
Bir UV spektrofotometresinde iki dakika boyunca 240 nanometrede katalaz kinetiğini okuyun ve ekranda gösterilen denklemi kullanarak enzim aktivitesini hesaplayın. Toplanan kan örneğini bir mililitre PBS ile seyreltin. Dokuz dakika boyunca 381 G'de santrifüjleyin ve peleti 50 mililitre PBS ile tekrar süspanse edin.
30 mikrolitre kan örneğini 70 mikrolitre düşük erime noktalı agaroz veya LMPA içinde %0.5 agaroz konsantrasyonunda karıştırarak ikinci katmanı oluşturun. Daha önce 100 mikrolitre %0,5 normal erime noktalı agaroz içeren birinci katmanla kaplanmış bir slayta 50 mikrolitre ikinci katman yerleştirin. Slaytı bir lamel ile örtün ve ikinci katmanı katılaşmak için 10 dakika boyunca dört santigrat derecede soğukta bekletin.
Katılaşmadan sonra lamel çıkarın. 100 mikrolitre %0,5 LMPA sererek üçüncü katmanı oluşturun ve slaytı tekrar kapatın. Üçüncü katman katılaştıktan sonra, lamel çıkarın ve her bir slaytı aynı gün hazırlanan lizis solüsyonunu içeren 100 mililitrelik bir coplin kavanozuna daldırın.
Koplin kavanozlarını, lizisin oluşması için karanlıkta bir saat boyunca dört santigrat derecede soğuk bir banyoya koyun. Lizisin sonunda, slaytları çıkarın ve DNA'nın gevşemesine izin vermek için dört santigrat derecede 15 dakika boyunca elektroforez tankındaki elektroforez tampon çözeltisine daldırın. Nükleer DNA çözüldükten sonra, aynı tampon üzerinde dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 25 volt ve 250 miliamperde elektroforez gerçekleştirin.
Elektroforezin sonunda, beş dakika boyunca üç kez iki mililitre tris hidroklorik çözelti ekleyerek slaytlardaki numuneleri nötralize edin. Numuneleri kurutmak için dört santigrat derecede %95 alkol içeren 100 mililitrelik coplin kavanozlarına yerleştirin. Slaytın ortasına 10 mikrolitre DAPI ekleyerek numuneleri boyayın.
Daha sonra boyayı bir lamel ile numunelerin üzerine yayın. Slaytları NU filtreli bir floresan fotomikroskop altında inceleyin. Nükleoidden DNA göçünün uzunluğunu değerlendirerek DNA hasarını ölçün.
Bu durumda, örtüşme olmadan rastgele seçilen 100 hücrede görsel olarak belirleyin. Daha sonra DNA hasarını, sıfırdan bire hasar yok, ikisi minimum hasar için, üçü orta hasar için ve dördü maksimum hasar için olmak üzere dört sınıfa ayırın. Verileri, her tedavi grubu için ortalama hasarlı hücre sayısı ve ortalama Comet skoru olarak ifade edin.
Son olarak, bu verilerden, ekranda gösterilen denklemi kullanarak her bir test organizması için genetik hasar indeksini veya GDI'yi hesaplayın. Boana pulchella ve Leptodactylus luctator erginlerinin ölçekli kütle indeksi bu şekilde gösterilmiştir. Ölçeklendirilmiş kütle indeksinin analizi için, ölçeklendirme üssünü belirlemek için türler için SVL ile vücut kütlesi arasındaki güç fonksiyonu ilişkisini gösteren doğrusal olmayan bir regresyon analizi yapılmıştır.
Ölçekli kütle indeksi, aynı türden yetişkin veya genç gruplarını karşılaştırmak için kullanışlıdır. Boana raniceps karaciğerinin histolojik kesitleri burada sunulmuştur. Bu bölümlerden daha fazla miktarda c ve hepatosit ve hepatositlerin çekirdeğinin daha büyük boyutları gözlenebilir.
Boana pulchella'da bir herbisit senaryosu maruziyetinde sitogenetik biyobelirteçlerin farklı ve tamamlayıcı tepkileri bu şekilde gösterilmiştir. Burada siyah çubuklar 48 saati, gri çubuklar ise 96 saati gösterir. Maruz kalma süresi ve konsantrasyon burada her zaman bir faktör olarak düşünülmelidir, çünkü belirli bir zaman veya konsantrasyon hasara neden olmak için yeterli olmayabilir.
Temsili görüntü, biyobelirteçlerin biyobelirteç yanıt indeksi ile nasıl ilişkili olduğunu açıklar. Burada mavi renk kontrol grubunu, turuncu, sarı ve yeşil renkler ise BDE 209'a maruz kalma senaryolarını gösterir. Bu veriler, katalazın, stres etkeninin en yüksek konsantrasyonlarda bulunduğu stres durumları için etkili bir biyobelirteç olduğunu göstermektedir.
Vücut kondisyon indeksini hesaplarken, sürekli olarak aynı mesafeden fotoğraf çekin. Kurbağa yavrularında, yaka yüzgeci hariç, SVL vücut uzunluğunu kloakal tüpe kadar ölçün. Bu yaklaşım, amfibi fizyolojisini ve çevresel değişikliklerin etkisini güvenli bir şekilde ele almaktadır.
Alternatif potansiyel olarak invaziv biyobelirteçler mevcut olsa da, bu yöntemler oksidatif stres, toksikodinamik ve toksikogenetik hakkında bilgi sunar. Oksidatif stres ile ilgili ek enzim ölçümleri alternatif metodolojiler olarak hizmet edebilir. Renk farkı analizi tekniği, renk eşitsizliklerine dayalı olarak fotomikrograflardaki doku tepkilerini değerlendirir.
Pigment sistemi için, programın kalibrasyonunun fotomikrograf ile uyumlu olduğundan emin olun. Bu gelişmiş teknik, ksenobiyotiklerin çeşitli hücre tiplerinde DNA'yı doğrudan etkileyip etkilemediğini araştırmada, diğer sitogenetik tekniklerin ele alamadığı genetik materyal oksidatif hasar ve onarım süreçleri ile ilgili soruları ele almada etkilidir.
