Bu çalışma, Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Kalkınma Konseyi (CNPq, Brezilya) [hibe numaraları 428048/2018-8 ve 402556/2022-4] ve Brasilia Üniversitesi (Brezilya) tarafından finanse edilmiştir. Yazar, bu araştırmada kullanılan akıllı telefonlarına erişim sağladıkları için Dr. Duarte Nuno Carvalho ve Dr. Evelyn Santos'a (i3s, Porto, Portekiz) teşekkür eder.

1. Bradford protein tahlil reaktifinin hazırlanması
<ol><li>100 mg Coomassie Brilliant Blue G'yi 50 mL% 95 (a / h) etanol içinde çözün. Coomassie Brilliant Blue G tamamen eriyene kadar karıştırın. DİKKAT: Etanol yanıcıdır ve göz tahrişine neden olur. Alevlerden kaçının ve gözlük kullanın.</li>
	<li>Önceki çözeltiye dikkatlice 100 mL %85 (a/h) fosforik asit ekleyin. DİKKAT: Fosforik asit metaller için aşındırıcıdır ve cilt korozyonuna, ciddi göz hasarına ve akut ağız toksisitesine neden olur. Eldiven ve gözlük takın.</li>
	<li>Coomassie Brilliant Blue G, etanol ve fosforik asit içeren çözeltiyi 600 mL deiyonize suya yavaşça ekleyin.</li>
	<li>Çözeltiyi 1.000 mL'lik bir nihai hacme seyreltin. Analiz edilecek numune sayısına göre ölçeği büyütün veya küçültün. Orijinal yöntem7'de açıklandığı gibi, çalışan Bradford reaktifindeki nihai konsantrasyonlar %0.01 (a/h) Coomassie Brilliant Blue G, %4.7 (a/h) etanol ve %8.5 (a/h) fosforik asit olmalıdır.</li>
	<li>Filtre kağıdından (Whatman #1 kağıdı veya eşdeğeri) süzülen çözünmeyen malzemeleri çıkarın.</li>
	<li>Reaktif, oda sıcaklığında (RT) saklandığında ve ışıktan korunduğunda birkaç hafta stabildir. Zamanla çökeltiler oluşabileceğinden gerektiği gibi filtreleyin. NOT: Alternatif olarak, seyreltmeye ve kullanıma hazır Bradford reaktifleri ticari olarak temin edilebilir. Reaktifi hazırlamak için üreticinin talimatlarını izleyin ve bir sonraki adıma geçin.</li>
</ol>2. Protein standart çözeltilerinin hazırlanması
<ol><li>Standart olarak kullanılacak izole edilmiş bir proteinin stok çözeltisini hazırlayın (bkz. adım 2.4). Uygun fiyatlı ve yaygın olarak kullanılan bir protein, sığır serum albüminidir (BSA). Diğer seçenekler ovalbümin ve sığır gama globulinidir.</li>
	<li>Standart olarak kullanılan proteinin molar absorptivesi biliniyorsa, stok çözeltisinin konsantrasyonunu bir spektrofotometrede kontrol edin.</li>
	<li>BSA için yaygın olarak kullanılan bir formül BSA (mg/mL) = (A280/6.6) × 10'dur, burada A280, uygun bir boşluğa karşı okunan 1 cm'lik bir yol uzunluğuna sahip 280 nm'de absorbanstır (yani, ε280%1 = 6.6)7. Örneğin, 0.8 mg / mL BSA, 280 nm'de 0.528'lik bir absorbansa sahiptir.</li>
	<li>Standart eğriyi oluşturmak için, 0.025 mg / mL ve 1.0 mg / mL içinde birkaç BSA dilüsyonu hazırlayın. Bunlar, kuyucuk başına 10 μL'lik bir numune hacmi eklendikten sonra kuyu başına 0.25-10 μg BSA ile sonuçlanacaktır. NOT: Protein standart çözeltileri, numuneleri hazırlamak için kullanılan ortamla aynı bileşime (nihai konsantrasyon) sahip bir ortamda hazırlanmalıdır.</li>
</ol>3. Tahlil
<ol><li>0.025-1.0 mg/mL'lik standart eğri aralığında bir protein konsantrasyonu elde etmek için numuneleri seyreltin. Aralık içinde birkaç (en az 3) numune seyreltmesine sahip olun. NOT: Numuneler, fosfat tamponlu salin (PBS) veya Bradford reaktifi ile uyumlu başka herhangi bir ortam/tampon bileşimi ile seyreltilebilir. Orta bileşenlerin nihai konsantrasyonu, standart ve numuneler arasında farklılık göstermemelidir.</li>
	<li>Her protein standart çözeltisinden 10 μL'yi 96 oyuklu bir mikroplakanın üç oyuğuna (yani üç kopya halinde) ekleyin. 0 (sıfır) protein noktası için, standart çözeltileri ve numune seyreltmelerini hazırlamak için kullanılan 10 μL tampon/ortam ekleyin.</li>
	<li>Başka bir kuyucuk grubuna, aynı 96 oyuklu mikroplakanın üç oyuğuna (yani üç kopya halinde) her bir numune seyreltmesinden 10 μL ekleyin. Bir yaklaşım, bir numunenin farklı hacimlerini eklemek ve kuyu başına 10 μL'ye kadar bir ortamla tamamlamaktır (örneğin, 0.5 μL, 1 μL, 2 μL, 4 μL ve 8 μL numune artı 9.5 μL, 9 μL, 8 μL, 6 μL ve 2 μL ortam).</li>
	<li>Tüm kuyucuklara 250 μL Bradford protein tahlil reaktifi ekleyin. Tipik bir mikroplaka kurulumu Şekil 2'de gösterilmektedir. Bu örnekte, bir mikroplaka okuyucusunda boş olarak hizmet etmek üzere 260 μL (kuyu başına son hacim) su içeren bir dizi boş kuyu dahil edilmiştir (adım 4.5). Bu, yalnızca absorbans verileri de toplanacaksa gereklidir. NOT: Tahlil her gerçekleştirildiğinde aynı mikroplaka numunesinde standart bir eğri hazırlayın. Başka bir deyişle, numune sayısı başka bir plaka gerektiriyorsa, ikinci plakada başka bir standart eğri hazırlayın ve bu şekilde devam edin.</li>
	<li>Sonuçları (bölüm 4) 5-15 dakika içinde kaydedin.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65547/65547fig02v2.jpg"> Şekil 2: Bradford protein testi için tipik bir plaka düzeni. Boş, bir mikroplaka okuyucusunda boş olarak kullanılacak 260 μL su içeren üç kuyuyu ifade eder. STD, protein standartlarını ifade eder. S1-S6 altı farklı örnektir. SX_1-SX_4, her numune için dört farklı numune seyreltmesidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65547/65547fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
4. Sonuçların kaydedilmesi
<ol><li>İyi aydınlatılmış bir odada, mikroplakayı bir elinizle tek tip beyaz bir arka plana (örneğin bir kağıt yaprağı) karşı tezgaha paralel tutun. Plakaya bir kabarcık seviyesi yerleştirerek doğru hizalamayı sağlayın.</li>
	<li>Öte yandan, akıllı telefonu tezgaha ve mikroplakaya paralel tutun (bazı kamera uygulamaları cihazın eğimini faydalı bir şekilde gösterir) ve tüm mikroplakanın bir veya birkaç fotoğrafını çekin (Şekil 3). iOS cihazlarda, Izgara seçeneğini etkinleştirerek kamera ayarlarında kamera seviyesi göstergesini açın. Android cihazlarda, Çerçeveleme İpuçları'nı etkinleştirerek kamera ayarlarında kamera seviyesi göstergesini açın.</li>
	<li>Özel bir aydınlatma aparatı gerekmez, ancak gölge ve yansımalardan kaçınmaya özen gösterin. Örneğin, plakayı veya arka planı akıllı telefonla gölgelendirmekten kaçının ve arka planı mikroplaka ile gölgelendirmekten kaçının. Kuyu alanının kenarlarındaki küçük yansımalar sorun değildir; Renk verileri, her kuyunun ortasındaki çok küçük bir alandan çıkarılabilir.</li>
	<li>Arka plan tekdüzeliği, gölgeler ve yansımalar için resmi kısaca kontrol edin. Ayrıca, kuyuların açısına bir göz atın; Her kuyunun merkezi doğrudan görünür olmalıdır (yani, kuyu duvarlarının arkasında değil).</li>
	<li>Mikroplaka absorbans okumaları ile resim renk verileri arasında karşılaştırma yapılmak isteniyorsa, mikroplakayı bir mikroplaka okuyucusunda 590 nm ve 450 nm'de okuyun21.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65547/65547fig03v2.jpg"> Şekil 3: Bradford protein testinin sonuçlarının yakalanması. İyi aydınlatılmış bir odada, mikroplaka tek elle tek tip bir arka plana karşı tezgaha paralel olarak konumlandırılır. Öte yandan, akıllı telefon tezgaha ve mikroplakaya paralel olarak tutulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65547/65547fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
5. Renk verilerini otomatik olarak çıkarma
<ol><li>ImageJ ve ReadPlate22'yi indirin, bir ImageJ eklentisi https://imagej.nih.gov/ij/plugins/readplate/index.html adresinde mevcuttur (bu bir .txt dosyasıdır).</li>
	<li>ImageJ'yi açın, Eklentiler > Yükle'ye tıklayın ve adım 6.1'de indirilen dosyayı seçin.</li>
	<li>Analiz Et > Ölçümleri Ayarla'ya tıklayarak ölçüm parametrelerini ayarlayın ve aşağıdaki seçenekleri kontrol edin: Alan; Standart sapma; Min ve maks gri değeri; Ortalama gri değer; Modal gri değer. Pencerenin alt kısmında, Yeniden Yönlendir'i şu şekilde ayarlayın: Yok ve Ondalık basamaklar (0-9): 3.</li>
	<li>Dosya > Aç'a gidin ve 4. adımda çekilen mikroplaka resmini seçin.</li>
	<li>Eklentiler > ReadPlate'e gidin. Yönergeleri okuyun ve ardından Tamam'ı tıklatın.</li>
	<li>Kuyu sayısını seçin: 96.</li>
	<li>Eklenti tarafından otomatik olarak yüklenen Dikdörtgen seçim aracını kullanarak, A1 kuyusunun ortasından başlayıp H12 kuyusunun ortasında biten bir dikdörtgen yapın. Ardından, Tamam'ı tıklatın.</li>
	<li>Mavi kanalı seçin ve Tamam'a tıklayın.</li>
	<li>Tamam'a tıklayarak varsayılan parametreleri onaylayın.</li>
	<li>Yazılımın her bir kuyucuğun içindeki bir alanı tanımlayıp tanımlamadığını ve seçilen alanların anormal gölgeler veya yansıma olan alanları kapsayıp kapsamadığını kontrol edin. Tamam'a tıklayın.</li>
	<li>Sonuçları kaydedin ve yeşil kanal için 5.8-5.10 arasındaki adımları tekrarlayın.</li>
	<li>Her renk için modu kullanarak mavi-yeşil oranını hesaplayın. NOT: Hesaplama manuel olarak veya R, Microsoft Excel veya GraphPad Prism gibi okuyucu tercihlerinin yazılımı kullanılarak yapılabilir.</li>
</ol>6. Renk verilerinin çıkarılması-Manuel olarak
<ol><li>Ücretsiz ve açık kaynaklı bir grafik düzenleyici olan Inkscape'i indirin. NOT: Rengi tanımlamak ve RGB verilerini ayıklamak için renk seçici aracına sahip herhangi bir yazılım (genellikle göz damlalığı olarak gösterilir) kullanılabilir.</li>
	<li>Inkscape'i açın, Dosya > Aç'a gidin. Adım 4'te çekilen mikroplaka resmini seçin.</li>
	<li>Sol üst tarafta ok olarak gösterilen Nesneleri Seç ve Dönüştür (S) aracını seçin ve resme tıklayın. Kesikli çizgi kenarlığı seçimi gösterir.</li>
	<li>Sol tarafta göz damlalığı olarak gösterilen Görüntüden Renk Seç (D) aracını seçin.</li>
	<li>Bir kuyunun ortasına tıklayın. Alt paneldeki renk ("Dolgu:") buna göre değişecektir. Renge tıklayın ve sağ tarafta bir Dolgu ve Kontur sekmesi açılacaktır.</li>
	<li>Düz Renk açılır menüsünü RGB olarak değiştirin. Her kuyu için mavi ve yeşil kanallar için gösterilen değerleri kaydedin.</li>
	<li>Kaydedilen değerleri kullanarak mavi-yeşil oranını hesaplayın. NOT: Hesaplama manuel olarak veya R, Microsoft Excel veya GraphPad Prism gibi okuyucu tercihlerinin yazılımı kullanılarak yapılabilir.</li>
</ol>7. Standart eğriler oluşturma ve bilinmeyenleri tahmin etme
<ol><li>Ortalama yeşil-mavi yoğunluk oranını, protein standart konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizin. NOT: Verileri manuel olarak veya R, Microsoft Excel veya GraphPad Prism gibi okuyucu tercihlerinin yazılımını kullanarak çizin.</li>
	<li>Her numune ve seyreltme için ortalama yeşil-mavi yoğunluk oranını hesaplayın.</li>
	<li>Numune için elde edilen sinyalin protein standardının doğrusal aralığında olup olmadığını kontrol edin.</li>
	<li>Standart eğrinin minimum veya maksimum değerlerinin altındaki veya üstündeki herhangi bir değeri yok sayın.</li>
	<li>Numunedeki protein miktarını tahmin etmek için standart eğriyi tanımlayan doğrusal denklemi kullanın. Hesaplanan değerleri buna göre seyreltme faktörü ile çarpın.</li>
</ol>

Bradford Tahlili Kullanarak Proteini Ölçmek için Analitik Bir Cihaz Olarak Akıllı Telefon

<ol>
	<li>Zaguri, M., Kandel, S., Rinehart, S. A., Torsekar, V. R., Hawlena, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quantification+in+ecological+studies:+A+literature+review+and+empirical+comparisons+of+standard+methodologies.">Protein quantification in ecological studies: A literature review and empirical comparisons of standard methodologies.</a> Methods in Ecology and Evolution. 12 (7), 1240-1251 (2021).</li><li>Koga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+electrical+stimulation+and+heat+shock+ameliorates+progressive+proteinuria+and+renal+inflammation+in+mouse+model+of+Alport+syndrome.">Mild electrical stimulation and heat shock ameliorates progressive proteinuria and renal inflammation in mouse model of Alport syndrome.</a> PLoS One. 7 (8), e43852 (2012).</li><li>Peterson, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+total+protein.">Determination of total protein.</a> Methods in Enzymology. 91, 95-119 (1983).</li><li>Goldfarb, A. R., Saidel, L. J., Mosovich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultraviolet+absorption+spectra+of+proteins.">The ultraviolet absorption spectra of proteins.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 397-404 (1951).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li><li>Datki, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+BisANS+fluorescent+dye+for+developing+a+novel+protein+assay.">Application of BisANS fluorescent dye for developing a novel protein assay.</a> PLoS One. 14 (4), e0215863 (2019).</li><li>Van Noorden, R., Maher, B., Nuzzo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+top+100+papers.">The top 100 papers.</a> Nature. 514 (7524), 550-553 (2014).</li><li>. Scopus Available from: <a target="_blank" href="https://www.scopus.com/">https://www.scopus.com/</a> (2022)</li><li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay.">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Analytical Biochemistry. 151 (2), 369-374 (1985).</li><li>Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spectral+study+of+the+charge+forms+of+Coomassie+Blue+G.">A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G.</a> Analytical Biochemistry. 209 (2), 258-266 (1993).</li><li>Pande, S. V., Murthy, M. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+micro-Bradford+procedure+for+elimination+of+interference+from+sodium+dodecyl+sulfate,+other+detergents,+and+lipids.">A modified micro-Bradford procedure for elimination of interference from sodium dodecyl sulfate, other detergents, and lipids.</a> Analytical Biochemistry. 220 (2), 424-426 (1994).</li><li>Gogstad, G. O., Krutnes, M. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+in+cell+suspensions+using+the+Commassie+brilliant+blue+dye-binding+assay.">Measurement of protein in cell suspensions using the Commassie brilliant blue dye-binding assay.</a> Analytical Biochemistry. 126 (2), 355-359 (1982).</li><li>Friedenauer, S., Berlet, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+and+variability+of+the+Bradford+protein+assay+in+the+presence+of+detergents.">Sensitivity and variability of the Bradford protein assay in the presence of detergents.</a> Analytical Biochemistry. 178 (2), 263-268 (1989).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+uniformity+in+the+response+of+the+Coomassie+blue+G+protein+assay+to+different+proteins.">Increased uniformity in the response of the Coomassie blue G protein assay to different proteins.</a> Analytical Biochemistry. 184 (1), 111-116 (1990).</li><li>Zor, T., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+Bradford+protein+assay+increases+its+sensitivity:+Theoretical+and+experimental+studies.">Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: Theoretical and experimental studies.</a> Analytical Biochemistry. 236 (2), 302-308 (1996).</li><li>Gee, C. T., Kehoe, E., Pomerantz, W. C. K., Penn, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+protein+concentrations+using+smartphone+colorimetry:+A+new+method+for+an+established+test.">Quantifying protein concentrations using smartphone colorimetry: A new method for an established test.</a> Journal of Chemical Education. 94 (7), 941-945 (2017).</li><li>de Camargo, C., Vicentini, M., Gobbi, A., Martinez, D., Lima, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smartphone+for+point-of-care+quantification+of+protein+by+Bradford+assay.">Smartphone for point-of-care quantification of protein by Bradford assay.</a> Journal of the Brazilian Chemical Society. 28 (4), 689-693 (2016).</li><li>Moreira, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGBradford:+Accurate+measurement+of+protein+concentration+using+a+smartphone+camera+and+the+blue+to+green+intensity+ratio.">RGBradford: Accurate measurement of protein concentration using a smartphone camera and the blue to green intensity ratio.</a> Analytical Biochemistry. 655, 114839 (2022).</li><li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linearization+of+the+Bradford+Protein+Assay.">Linearization of the Bradford Protein Assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (38), 1918 (2010).</li><li>Angelani, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metabolic+control+analysis+approach+to+introduce+the+study+of+systems+in+biochemistry:+the+glycolytic+pathway+in+the+red+blood+cell:+Metabolic+control+analysis+and+the+glycolytic+pathway.">A metabolic control analysis approach to introduce the study of systems in biochemistry: the glycolytic pathway in the red blood cell: Metabolic control analysis and the glycolytic pathway.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (5), 502-515 (2018).</li></ol>

Yazarın beyan etmesi gereken herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu makale, bir Bradford protein tahlilinden veri kaydetmek, renk verilerini çıkarmak ve yakın zamanda açıklandığı gibi biyolojik örneklerdeki protein seviyelerini doğru bir şekilde ölçmek için bir akıllı telefon kamerası kullanan bir yöntem olan RGBradford'u açıklamaktadır20. Orijinal RGBradford yönteminden bir fark, burada bir ImageJ eklentisi22 ile renk verilerini otomatik olarak elde etmek için bir prosedürün kullanılmış olmasıdır. RGBradfor...

Aşağı akış kullanımından bağımsız olarak (örneğin, ELISA, enzim kinetiği, western blotlama, protein saflaştırma ve kütle spektrometresi), yaşam bilimleri laboratuvarlarında doğru analiz için protein miktar tayini çok önemlidir. İkincil okumalar olarak kullanımlarına ek olarak (yani, protein kütlesi başına analitlerin nispi seviyelerini hesaplamak için), bir numunedeki protein seviyeleri de istenen çıktının kendisi olabilir. Örneğin, gıda kaynakları1 veya idrar2'deki protein seviyeleri ile ilgilenilebilir. Doğrudan UV absorbans okumaları 4, protein-bakır şelasyonu 5,6, protein boyası bağlayıcı kolorimetrik deneyler 7 ve protein boyası bağlayıcı floresan deneyleri 8 dahil olmak üzere numunelerde3 protein konsantrasyonunu ölçmek için birçok yöntem mevcuttur. Protein kantitasyonunun önemi, en çok alıntı yapılan literatürün 5,7'ünde protein ölçüm yöntemlerini5,7 açıklayan iki makaleninvarlığıyla kanıtlanmıştır 9,10. Birçok yazarın birincil olmayan referanslara atıfta bulunarak veya hiçbir şeyden alıntı yapmayarak gerçek alıntılarını ihmal etmesine rağmen, Lowry protein tahlilini ve Bradford protein tahlilini açıklayan orijinal makalelerin herbiri 10 >200.000 alıntıdır.
Bradford testinin popülaritesi, satın alınabilirliğinden, basitliğinden, hızından ve hassasiyetinden kaynaklanmaktadır. Test, asidik koşullar altında proteinler ve Coomassie Brilliant Blue G boyası arasındaki etkileşime dayanmaktadır. Tahlil koşulları altında (yani, düşük pH), boya üç şekilde bulunur: λ ile kırmızı katyonik formmaks 470 nm'de; λmax 650 nm'de yeşil nötr bir form; ve λ ile mavi anyonik formmaks 590 nm 11,12'de (Şekil 1). Katyonik form, proteinlerin yokluğunda baskındır. Proteinler boya ile etkileşime girdiğinde, mavi anyonik formu stabilize ederek çözeltinin renginde kahverengimsiden maviye gözle görülür bir değişikliğe neden olurlar. Genellikle, boyanın mavi formunun konsantrasyonundaki değişiklik, 590-595 nm'deki absorbansı tahlildeki protein miktarı ile orantılı olan spektrofotometrik olarak ölçülür.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65547/65547fig01v2.jpg"> Şekil 1: Bradford testi koşulları altında Coomassie parlak mavi G absorpsiyon spektrumları. Üç ana tepe noktası, boyanın kırmızı (470 nm), yeşil (650 nm) ve mavi (590 nm) formlarının λmax'ını gösteren oklarla işaretlenmiştir. Spektrumlar, protein yokluğunda (sarı çizgi) ve 3 μg (gri çizgi) ve 10 μg (mavi çizgi) sığır serum albümini varlığında kaydedildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65547/65547fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bradford testinin yaygın kullanımı, çeşitli sınırlamaların tanımlanmasına (örneğin, farklı proteinlere11 değişken tepkiler ve lipitler13 ve deterjanlar7 tarafından girişim) ve performansını iyileştirmek için modifikasyonların geliştirilmesine yol açmıştır (örneğin, deterjanlarıneklenmesi 14,15, alkalinizasyon14,16 ve absorbans oranının kullanılması17). Testin kendisindeki değişikliklere ek olarak, analitik sinyalleri yakalamak için akıllı telefonlar veya kameralar gibi alternatif cihazların kullanımı da tanımlanmıştır 18,19,20. Gerçekten de, akıllı telefonları taşınabilir kimyasal analizörler olarak kullanan yöntemlerin geliştirilmesi aktif bir araştırma alanı olmuştur. Akıllı telefonların kullanım motivasyonu, bu cihazların satın alınabilirliğinden, taşınabilirliğinden, kullanım kolaylığından ve yaygın olarak bulunmasından kaynaklanmaktadır.
Bu makale, analitik bir cihaz olarak bir akıllı telefon kullanan RGBradford testi20'yi kullanarak protein ölçümü için bir protokol sağlar. Orijinal RGBradford yayını20'nin aksine, burada renk çıkarma işlemini kolaylaştıran bir prosedür tanıtıldı. Bir mikroplaka resminin her bir kuyucuğundan renk bilgilerini otomatik olarak çıkarmak için ücretsiz olarak kullanılabilen bir yazılım uygulamasının kullanılmasını içerir, bu da önemli ölçüde zaman ve emek tasarrufu sağlar. Bu, bir grafik düzenleme yazılımı uygulaması20 kullanarak her bir kuyudan renk verilerini tek tek manuel olarak elde etmenin önceki yöntemine bir alternatiftir. Sonuç olarak, numunelerdeki protein seviyeleri, bir akıllı telefonla çekilen bir mikroplaka resminden çıkarılan renk verileri kullanılarak ölçülebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates&#160;</td>
			<td>Jet Biofil, Guangzhou, China</td>
			<td>TCP011096</td>
			<td>Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>B0770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPhone 11</td>
			<td>Apple</td>
			<td>MWM02BR/A</td>
			<td>Can be substituted with other smartphone equiped with a camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPhone 14 Pro</td>
			<td>Apple</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>695017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Redmi Note 9 Pro</td>
			<td>XIAOMI&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S22 Ultra</td>
			<td>Samsung&#160;</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax 384 Plus. Microplate reader.</td>
			<td>Molecular Devices, San Jose, CA</td>
			<td>PLUS 384</td>
			<td>Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rgbradford: protein quantitation with a smartphone camera

Protein miktarı, yaşam bilimleri araştırmalarında önemli bir prosedürdür. Diğer birçok yöntem arasında, Bradford testi en çok kullanılanlardan biridir. Yaygın olması nedeniyle, Bradford testinin sınırlamaları ve avantajları, performansını artırmak için orijinal yöntemin çeşitli modifikasyonları da dahil olmak üzere kapsamlı bir şekilde rapor edilmiştir. Orijinal yöntemin değişikliklerinden biri, analitik bir araç olarak bir akıllı telefon kamerasının kullanılmasıdır. Bradford tahlili koşullarında var olan Coomassie Brilliant Blue boyasının üç formundan yararlanan bu makale, bir mikroplakanın tek bir resminden çıkarılan renk verilerini kullanarak numunelerdeki proteinin nasıl doğru bir şekilde ölçüleceğini açıklamaktadır. Testi bir mikroplakada gerçekleştirdikten sonra, bir akıllı telefon kamerası kullanılarak bir resim çekilir ve ücretsiz ve açık kaynaklı bir görüntü analiz yazılımı uygulaması kullanılarak resimden RGB renk verileri çıkarılır. Daha sonra, standart bir eğriye dayalı olarak protein içeriğini hesaplamak için bilinmeyen protein konsantrasyonlarına sahip numunelerin mavinin yeşile oranı (RGB ölçeğinde) kullanılır. RGB renk verileri kullanılarak hesaplanan değerler ile geleneksel absorbans verileri kullanılarak hesaplanan değerler arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir.

Regardless of the downstream use (e.g., ELISA, enzyme kinetics, western blotting, protein purification, and mass spectrometry), protein quantification is crucial for accurate analysis in life sciences laboratories. In addition to their use as secondary readouts (i.e., to calculate relative levels of analytes per mass of protein), protein levels in a sample can also be the desired output itself. For example, one can be interested in protein levels in food resources1 or in urine2. There are many methods available to measure protein concentration in samples3, including direct UV absorbance readings4, protein-copper chelation5,6, protein-dye binding colorimetric assays7, and protein-dye binding fluorescent assays8. The relevance of protein quantitation is evidenced by the presence of two papers describing protein measurement methods5,7 in the top-3 of the most cited literature9,10. Despite the fact that many authors neglect their actual citation by citing non-primary references or not citing anything at all, the original papers describing the Lowry protein assay and the Bradford protein assay amount &#62;200,000 citations each10.
The popularity of the Bradford assay stems from its affordability, simplicity, speed, and sensitivity. The assay is based on the interaction between proteins and the dye Coomassie Brilliant Blue G under acidic conditions. Under the conditions of the assay (i.e., low pH), the dye exists in three forms: a red cationic form with &#955;max at 470 nm; a green neutral form with &#955;max at 650 nm; and a blue anionic form with &#955;max at 590 nm11,12 (Figure 1). The cationic form predominates in the absence of proteins. As proteins interact with the dye, they stabilize the blue anionic form, causing a noticeable change in the color of the solution, from brownish to blue. Usually, the change in the concentration of the blue form of the dye is quantified spectrophotometrically, whose absorbance at 590-595 nm is proportional to the quantity of protein in the assay.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65547/65547fig01v2.jpg" /> 
Figure 1: Coomassie brilliant blue G absorption spectra under the conditions of the Bradford assay. The three main peaks are marked with arrows indicating the &#955;max of the red (470 nm), green (650 nm), and blue (590 nm) forms of the dye. Spectra were recorded in the absence of protein (yellow line) and in the presence of 3 &#181;g (gray line) and 10 &#181;g (blue line) of bovine serum albumin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65547/65547fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The widespread use of the Bradford assay has led to the identification of several limitations (e.g., variable responses to different proteins11, and interference by lipids13 and detergents7) and the development of modifications to improve its performance (e.g., the addition of detergents14,15, alkalinization14,16 and use of the ratio of absorbances17). In addition to modifications in the assay itself, the use of alternative devices, such as smartphones or cameras, to capture analytical signals have also been described18,19,20. Indeed, the development of methods that make use of smartphones as portable chemical analyzers has been an active area of research. The motivation for the use of smartphones stems from the affordability, portability, ease of use, and widespread availability of these devices.
This paper provides a protocol for protein quantification using the RGBradford assay20, which uses a smartphone as an analytical device. In contrast to the original RGBradford publication20, here, a procedure that streamlines the color extraction process has been introduced. It involves the utilization of a freely available software application to extract color information from each well of a microplate picture automatically, saving significant time and effort. This is an alternative to the previous method of manually acquiring color data from each well one by one using a graphics editor software application20. Ultimately, protein levels in samples can be quantified using color data extracted from a picture of a microplate taken with a smartphone.

Yazar Spotlight: Akıllı Telefon Kullanarak Bradford Tahlili ile Protein Miktar Tayinine Alternatif Bir Yaklaşım 

RGBradford: Akıllı Telefon Kamerası ile Protein Kantitasyonu

Our research focuses on understanding at the biochemical level how animals adapt to extreme environmental conditions. We explore questions about their response to lack of oxygen and suppression of metabolic rate. Specifically, we investigate endogenous antioxidants, oxidative stress, and cellularity stress response animals employ in a adverse environment.And to do so, we often quantify protein levels in our samples. This protocol addresses the need for an alternative method to obtain protein quantification data when resource are limited, making it a valuable tool in both educational and research contexts. The RG Bradford Assay offers a practical and reliable solution for protein concentration measurement that is accessible, simple, and accurate in scenarios where conventional equipment such as a microplate reader may be unavailable.

Şekil 4, renk verilerinin çıkarıldığı ve 450 nm ve 590 nm'de absorbansın kaydedildiği bir mikroplakanın resmidir. Burada temsili olarak bildirilen RGB renk verileri, bölüm 5'te açıklandığı gibi otomatik olarak elde edilmiştir. Tipik bir renk verisi modeli, mavi değerlerde bir artış ve kırmızı ve yeşil değerlerde bir azalmadır (Şekil 5). Tüm kuyucuklardaki belirgin yansımaya ve mükemmel hizalanmamış bir mikroplakaya (<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Approach to Protein Quantification by Bradford Assay Using a Smartphone at JoVE.com

Bu makale, Bradford tahlili ve analitik bir cihaz olarak bir akıllı telefon kullanarak protein miktar tayini için bir protokol sağlar. Numunelerdeki protein seviyeleri, bir akıllı telefonla çekilen bir mikroplaka resminden çıkarılan renk verileri kullanılarak ölçülebilir.

Protein quantitation is an essential procedure in life sciences research. Amongst several other methods, the Bradford assay is one of the most used. ...

Araştırmamız, hayvanların aşırı çevresel koşullara nasıl uyum sağladığını biyokimyasal düzeyde anlamaya odaklanmaktadır. Oksijen eksikliğine ve metabolik hızın baskılanmasına verdikleri tepkilerle ilgili soruları araştırıyoruz. Spesifik olarak, olumsuz bir ortamda kullanılan endojen antioksidanları, oksidatif stresi ve hücresel stres tepkisini araştırıyoruz.Ve bunu yapmak için, genellikle örneklerimizdeki protein seviyelerini ölçeriz. Bu protokol, kaynak sınırlı olduğunda protein miktar tayini verilerini elde etmek için alternatif bir yönteme duyulan ihtiyacı ele alır ve bu da onu hem eğitim hem de araştırma bağlamlarında değerli bir araç haline getirir. RG Bradford Testi, mikroplaka okuyucu gibi geleneksel ekipmanların kullanılamadığı senaryolarda erişilebilir, basit ve doğru olan protein konsantrasyonu ölçümü için pratik ve güvenilir bir çözüm sunar.

rgbradford-protein-quantitation-with-a-smartphone-camera

Research

JoVE Journal

Biochemistry

RGBradford: Protein Quantitation with a Smartphone Camera

1.8K Görüntüleme.  University of Brasilia. Araştırmamız, hayvanların aşırı çevresel koşullara nasıl uyum sağladığını biyokimyasal düzeyde anlamaya odaklanmaktadır. Oksijen eksikliğine ve metabolik hızın baskılanmasına verdikleri tepkilerle ilgili soruları araştırıyoruz. Spesifik olarak, olumsuz bir ortamda kullanılan endojen antioksidanları, oksidatif stresi ve hücresel stres tepkisini araştırıyoruz.Ve bunu yapmak için, genellikle örneklerimizdeki protein seviyelerini ölçeriz. Bu protokol, ka...

Video: Yazar Spotlight: Akıllı Telefon Kullanarak Bradford Tahlili ile Protein Miktar Tayinine Alternatif Bir Yaklaşım 

Protein quantitation is an essential procedure in life sciences research. Amongst several other methods, the Bradford assay is one of the most used. Because of its widespread, the limitations and advantages of the Bradford assay have been exhaustively reported, including several modifications of the original method to improve its performance. One of the alterations of the original method is the use of a smartphone camera as an analytical instrument. Taking advantage of the three forms of the Coomassie Brilliant Blue dye that exist in the conditions of the Bradford assay, this paper describes how to accurately quantify protein in samples using color data extracted from a single picture of a microplate. After performing the assay in a microplate, a picture is taken using a smartphone camera, and RGB color data is extracted from the picture using a free and open-source image analysis software application. Then, the ratio of blue to green intensity (in the RGB scale) of samples with unknown concentrations of protein is used to calculate the protein content based on a standard curve. No significant difference is observed between values calculated using RGB color data and those calculated using conventional absorbance data.

This paper provides a protocol for protein quantification using the Bradford assay and a smartphone as an analytical device. Protein levels in samples can be quantified using color data extracted from a picture of a microplate taken with a smartphone.

Biyokimya

Recording Bradford Protein Assay Results Using a Smartphone Camera

To begin sample preparation for the Bradford protein assay, dilute the protein samples to obtain protein concentrations within the standard curve range of 0.025 to 1.0 milligrams per milliliter. Create multiple sample dilutions per sample within this range. For the zero protein point, add 10 microliters of the buffer or medium used to prepare the standard solutions to the designated wells.Then add 10 microliters of each protein standard solution into a set of three wells serving as triplicates in a 96-well microplate. In a separate set of wells on the same 96-well microplate, add 10 microliters of each sample dilution in triplicates. Next, add 250 microliters of Bradford protein assay reagent to all wells.A layout of the final microplate setup is displayed on the screen. Proceed to record the results in a well illuminated room within 5 to 15 minutes of adding the assay reagent. Using one hand, hold the microplate against a uniform white background, ensuring it is parallel to the work bench.While using the other hand, hold a smartphone parallel to the bench and the microplate. Proceed to capture several pictures of the entire microplate. For iOS devices, enable the grid option in camera settings to turn on the camera level indicator.For Android devices, activate grid lines in camera settings to achieve the same. Although no special lighting apparatus is required, maintain caution while capturing the images properly. Avoid shading the plate or the background and prevent excessive reflection.Also, ensure not to tilt the plate. Inspect the picture for background, uniformity, shadows, and reflections. Also check the angle of the wells:The center of each well should be directly visible If desired, read the microplate in a microplate reader to compare the picture color data with the microplate absorbance readings.

Bradford Protein Testi Sonuçlarını Akıllı Telefon Kamerası Kullanarak Kaydetme

Automatically Extracting the Bradford Assay Data Recorded with a Smartphone

To extract the Bradford Assay data from the images of the microplate recorded using the smartphone camera, download the software image J and the ReadPlate plugin available as a text file. After opening image J, click on Plugins followed by Install, and select the downloaded ReadPlate plugin text file. Set the measurement parameters by clicking on Analyze, and then Set Measurements and checking the options:Area, Standard deviation, Minimum and maximum gray value, Mean gray value, Modal gray value.On the bottom of the window, set Redirect to as None and Decimal place as zero to 9 as 3. Go to File. Click Open and select the picture of the microplate taken using the smartphone.Go to Plugins followed by ReadPlate. Read the instructions and then click OK.Select the Number of wells as 96. Using the rectangular selection tool automatically loaded by the plugin, make a rectangle beginning in the center of the A1 well and ending in the center of the H12 well, then click OK.Select the Blue channel and click OK.Then confirm the default parameters by clicking on OK.Check if the software delineated an area inside each well, and if the selected areas are not covering areas with abnormal shadows or reflection.Once checked, click OK.Save the results before repeating the same for the Green channel. Calculate the Blue to-Green ratio using the mode for each color. The RGB color data obtained automatically from the picture of a microplate showed the typical increase in the blue values and a decrease in the red and green values for the BSA standard.Further, the color data extracted from the picture accurately reflected absorbance readings recorded at 450 and 590 nanometers. The standard curve obtained with the extracted color data depicting the signal versus BSA concentration was found to be linear as expected. A linear relationship between sample dilution and the signal was obtained for both absorbance readings as well as the extracted color data in two different protein samples.For both protein samples, some of the dilutions were not within the linear range of the standard curve. However, after ignoring those points, protein levels calculated using RGB data for both samples matched those calculated using the absorbance readings.

Akıllı Telefon ile Kaydedilen Bradford Test Verilerinin Otomatik Olarak Çıkarılması

Manually Extracting the Bradford Assay Data Recorded with a Smartphone

To manually extract the Bradford Assay data from the images of the microplate recorded using the smartphone camera, download Inkscape, a free and open source graphics editor. Open Inkscape, go to file, and click open"to select the picture of the microplate taken using the smartphone. Pick the select and transform objects S tool, which is depicted as an arrow on the top left side, and click on the picture.A dashed line border will indicate the selection. Then select the pick colors from Image D tool, which is depicted as an eyedropper on the left side. Next, click in the center of a well.The color on the bottom panel, fill, will change accordingly. Click on the color and a fill and stroke tab will pop up on the right side. Change the flat color dropdown menu to RGB.Record the values shown for the blue and green channels for each well. Calculate the blue to green ratio using the recorded values.