Bu araştırma, Xiamen Şehri Bilim ve Teknoloji Bürosu (3502Z20227197) ve Fujian Eyaleti Bilim ve Teknoloji Bürosu (No. 2019J01070, No.2021Y0027) tarafından finanse edilmiştir.

1. Hazırlık
<ol><li>Numune tedavisi<ol><li>Taze S. nudus'u (100 g) dikkatlice diseke edin ve bağırsağı ve iç sıvısını toplayın.</li>
		<li>Homojenizasyon (1.000 rpm, 60 sn) için 300 mL Tris-HCl tamponu (0,02 M, pH 7,4) ekleyin.</li>
		<li>Homojenatı 3x dondurarak çözün.</li>
		<li>Numuneyi santrifüj edin (10.956 × g, 0,5 saat, 4 °C) ve süpernatanı toplayın. Numuneyi daha sonraki kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Protein çökeltmesi<ol><li>Süpernatantı doymuş amonyum sülfat çözeltisi (dokuz hacim) ile karıştırın ve karışımın 4 ° C'de 12 saat beklemesine izin verin. NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve daha sonra devam edilebilir.</li>
		<li>Protein çökeltisini elde etmek için santrifüj (10.956 × g, 0.5 h, 4 °C); Daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Protein resüspansiyonu<ol><li>Protein çökeltisini 30 mL Tris-HCl tamponu (0.02 M, pH 7.4) ile yeniden askıya alın. Bu ham protein çözeltisini daha sonra kullanmak üzere 4 ° C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Afinite kromatografisi
<ol><li>Çözelti filtrasyonu<ol><li>Ham protein çözeltisini 0,22 μm'lik bir filtre membranından filtreleyin. Bu örneği daha sonra kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Kolon paketleme<ol><li>Arjinin-agaroz matris afinite kromatografi kolonu ve lizin-agaroz matris afinite kromatografisi kolonunu, uygun miktarda lizin-agaroz matriks ortamı ve arginin-agaroz matriks ortamını 5 mL boş kromatografi kolonuna yükleyerek paketleyin. NOT: Kolon 2-8 °C'de, matris mağaza tamponuna (%20 etanol) daldırılarak saklanabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Afinite saflaştırma<ol><li>Afinite kromatografisi kolonunu önce ddH2O (1 mL/dak, 10 sütun hacmi), ardından Tris-HCl tamponu (0,02 M, pH 8,0, 1 mL/dak, 5 sütun hacmi) ile dengeleyin.</li>
		<li>Protein çözeltisi numunesini önceden dengelenmiş kolona yükleyin (1 mL/dak, 1/3 sütun hacmi). NOT: Numune yükleme hacmi, sFE konsantrasyonuna bağlıdır.</li>
		<li>Kolonu Tris-HCl tamponu ile yıkayın (0,02 M, pH 8,0, beş sütun hacmi).</li>
		<li>Kolonu sırasıyla 0,15 M, 0,25 M, 0,35 M, 0,45 M, 0,55 M ve 0,65 M NaCl (1 mL/dak, beş sütun hacmi) ile kaldırın.</li>
		<li>0.15 M NaCl elüsyonunda görünmesi gereken elüsyon tepesini arayın ve ardından fraksiyonları 5 mL tüplerde toplayın.</li>
		<li>Elüsyon numunesini 3 kD ultra santrifüj filtre (3.944 × g, 1,5 saat, 4 °C) kullanarak konsantre edin. Bu örneği daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Saflık değerlendirmesi
<ol><li>Sodyum dodesil-sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) jel preparatı<ol><li>SDS-PAGE jeli, %5 konsantre jel ve %12 ayırma jeli13 kullanarak Laemmli'nin yöntemine göre hazırlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Elektroforez<ol><li>Numuneyi (15 μL) 5x SDS-PAGE protein yükleme tamponu (1/4 hacim) ile karıştırın, kaynar suda 5 dakika ısıtın, SDS-PAGE jeline yükleyin ve jeli 80 V, 60 mA'da 1,5 saat boyunca çalıştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Analiz<ol><li>Elektroforezden sonra, jeli üreticinin protokolüne göre bir Gümüş Leke Kiti ile lekeleyin ve kemilüminesan görüntüleme sistemi kullanarak lekeli jeli gözlemleyin.</li>
		<li>Aşağıdaki formülü kullanarak hedef proteinin saflığını analiz edin: hedef proteinin saflığı = hedef proteinin yoğunluk değeri / toplam proteinin yoğunluk değeri.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Fibrinolitik aktivite değerlendirmesi
<ol><li>Fibrin plaka hazırlama<ol><li>25 mg fibrinojen çözeltisini 1.25 mL fizyolojik salin ile karıştırarak hazırlayın.</li>
		<li>100 U trombini 1.05 mL fizyolojik salin ile tamamen karıştırarak trombin çözeltisini hazırlayın.</li>
		<li>22.5 mL Tris-HCl tamponuna (0.02 mol / L, pH 7.4) 0.5 g agaroz ekleyerek agaroz çözeltisini hazırlayın. Agaroz çözeltisini karıştırın ve tamamen çözünene kadar 100 ° C'de ısıtın.</li>
		<li>Agaroz çözeltisini yaklaşık 50 ° C'ye kadar soğutun ve fibrinojen çözeltisi ekleyin. Ardından, hemen trombin çözeltisini ekleyin, hızlıca karıştırın ve 60 mm'lik bir kültür kabına dökün.</li>
	</ol></li>
	<li>Yükleme<ol><li>Steril bir delici kullanarak hazırlanan fibrin plakalara 3 mm'lik kuyular delin ve kuyucukları 10 μL numunelerle doldurun.</li>
	</ol></li>
	<li>Analiz<ol><li>37 ° C'de 18 saatlik inkübasyondan sonra, bozunma bölgelerinin boyutunu hesaplayarak fibrinolitik aktiviteyi ölçün. Fibrinolitik aktivite = (numunenin bölge büyüklüğü / ürokinazın bölge boyutu) x 100 U. Bölge boyutu = çap x çap. NOT: Fizyolojik salin tamponu, ham protein (protokol adım 1.3.1'de elde edilen örnek) ve ürokinaz sırasıyla boş, negatif kontrol ve pozitif kontrol için kullanılmıştır. Ürokinaz ile karşılaştırıldığında, saflaştırılmış sFE'nin fibrinolitik aktivitesinin ~ 19.200 U / mL olduğunu bulduk.</li>
	</ol></li>
</ol>

Fibrinolitik Bir Enzimin Sipunculus nudus'tan Afinite Kromatografisi ile Saflaştırılması

<ol>
	<li>Rosell, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patients+with+COVID-19+have+elevated+levels+of+circulating+extracellular+vesicle+tissue+factor+activity+that+is+associated+with+severity+and+mortality-brief+report.">Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).</li><li>Schultz, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombosis+and+thrombocytopenia+after+ChAdOx1+nCoV-19+vaccination.+The+New+England.">Thrombosis and thrombocytopenia after ChAdOx1 nCoV-19 vaccination. The New England.</a> Journal of Medicine. 384 (22), 2124-2130 (2021).</li><li>von Kaulla, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urokinase-induced+fibrinolysis+of+human+standard+clots.">Urokinase-induced fibrinolysis of human standard clots.</a> Nature. 184 (4695), 1320-1321 (1959).</li><li>Van de Werf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+thrombolysis+with+tissue-type+plasminogen+activator+in+patients+with+evolving+myocardial+infarction.">Coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator in patients with evolving myocardial infarction.</a> The New England Journal of Medicine. 310 (10), 609-613 (1984).</li><li>Schaller, J., Gerber, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasmin-antiplasmin+system:+structural+and+functional+aspects.">The plasmin-antiplasmin system: structural and functional aspects.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (5), 785-801 (2011).</li><li>Ge, Y. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+antithrombotic+protease+from+marine+worm+Sipunculus+nudus.">A novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus nudus.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+a+novel+fibrinolytic+enzyme+from+culture+supernatant+of+Pleurotus+ostreatus.">Purification and characterization of a novel fibrinolytic enzyme from culture supernatant of Pleurotus ostreatus.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 24 (2), 245-253 (2014).</li><li>Choi, J. -. H., Sapkota, K., Kim, S., Kim, S. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Starase:+A+bi-functional+fibrinolytic+protease+from+hepatic+caeca+of+Asterina+pectinifera+displays+antithrombotic+potential.">Starase: A bi-functional fibrinolytic protease from hepatic caeca of Asterina pectinifera displays antithrombotic potential.</a> Biochimie. 105, 45-57 (2014).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+fibrinolytic+protein+From+Pheretima+vulgaris:+purification,+identification,+antithrombotic+evaluation,+and+mechanisms+investigation.">A novel fibrinolytic protein From Pheretima vulgaris: purification, identification, antithrombotic evaluation, and mechanisms investigation.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 772419 (2022).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant,+hypolipidemic+and+hepatic+protective+activities+of+polysaccharides+from+Phascolosoma+esculenta.">Antioxidant, hypolipidemic and hepatic protective activities of polysaccharides from Phascolosoma esculenta.</a> Marine Drugs. 18 (3), 158 (2020).</li><li>. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm Available from: <a target="_blank" href="https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en">https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en</a> (2019)</li><li>Li, W., Yuan, M., Wu, Y., Xu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+genes+expressed+differentially+in+female+and+male+gametes+of+Sipunculus+nudus.">Identification of genes expressed differentially in female and male gametes of Sipunculus nudus.</a> Aquaculture Research. 51 (9), 3780-3789 (2020).</li><li>Ossipow, V., Laemmlii, U. K., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+to+renature+DNA-binding+proteins+separated+by+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis.">A simple method to renature DNA-binding proteins separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 21 (25), 6040-6041 (1993).</li><li>Hsu, T., Ning, Y., Gwo, J., Zeng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+barcoding+reveals+cryptic+diversity+in+the+peanut+worm+Sipunculus+nudus.">DNA barcoding reveals cryptic diversity in the peanut worm Sipunculus nudus.</a> Molecular Ecology Resources. 13 (4), 596-606 (2013).</li><li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen-plasmin+system.+I.+Purification+and+properties+of+human+plasminogen.">Plasminogen-plasmin system. I. Purification and properties of human plasminogen.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 743-750 (1968).</li><li>Abiko, Y., Iwamoto, M., Shimizu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasminogen-plasmin+system.+II.+Purification+and+properties+of+human+plasmin.">Plasminogen-plasmin system. II. Purification and properties of human plasmin.</a> The Journal of Biochemistry. 64 (6), 751-757 (1968).</li><li>Wiman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-chromatographic+purification+of+human+&#945;2-antiplasmin.">Affinity-chromatographic purification of human &#945;2-antiplasmin.</a> The Biochemical Journal. 191 (1), 229-232 (1980).</li><li>Sandbjerg Hansen, M., Clemmensen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+purification+and+characterization+of+a+new+fast-acting+plasmin+inhibitor+from+human+platelets.+Evidence+for+non-identity+with+the+known+plasma+proteinase+inhibitors.">Partial purification and characterization of a new fast-acting plasmin inhibitor from human platelets. Evidence for non-identity with the known plasma proteinase inhibitors.</a> The Biochemical Journal. 187 (1), 173-180 (1980).</li><li>Pietrocola, G., Rindi, S., Nobile, G., Speziale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+human+plasma/cellular+fibronectin+and+fibronectin+fragments.">Purification of human plasma/cellular fibronectin and fibronectin fragments.</a> Fibrosis. 1627, 309-324 (2017).</li><li>Nabiabad, H. S., Yaghoobi, M. M., Javaran, M. J., Hosseinkhani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+and+purification+of+human+recombinant+tissue+type+plasminogen+activator+(rt-PA)+from+transgenic+tobacco+plants.">Expression analysis and purification of human recombinant tissue type plasminogen activator (rt-PA) from transgenic tobacco plants.</a> Preparative Biochemistry and Biotechnology. 41 (2), 175-186 (2011).</li><li>Shearin, T. V., Pizzo, S. V., Gonzalez-Gronow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+abnormalities+of+human+plasminogen+isolated+from+synovial+fluid+of+rheumatoid+arthritis+patients.">Molecular abnormalities of human plasminogen isolated from synovial fluid of rheumatoid arthritis patients.</a> Journal of Molecular Medicine. 75 (5), 378-385 (1997).</li></ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

sFE'nin tam gen dizisinin bulunamaması nedeniyle, şu anda kullanılan sFE, taze S. nudus14'ten ekstrakte edildi. Ayrıca, literatürde bildirilen sFE'nin saflaştırma prosedürleri, moleküler ağırlık, izoelektrik nokta, iyonik mukavemet ve polarite15,16 gibi sFE'nin bazı genel özelliklerine dayandığı için karmaşık ve maliyetliydi. Bugüne kadar sFE'nin afinite saflaştırma protokolü bildirilmemiştir. Bu çalışm...

Tromboz, özellikle Covid-19 küresel pandemisi 1,2 sonrasında halk sağlığı için büyük bir tehdittir. Klinik olarak, doku tipi plazminojen aktivatörü (tPA) ve ürokinaz (İngiltere) gibi birçok plazminojen aktivatörü (PA), trombolitik ilaçlar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. PA'lar, fibrini bozmak için hastaların plazminojenini aktif plazmine aktive edebilir. Bu nedenle, trombolitik verimlilikleri hastaların plazminojen durumu 3,4 ile büyük ölçüde kısıtlanmaktadır. Metalloproteinaz plazmin ve serin plazmin gibi fibrinolitik ajanlar, pıhtıları doğrudan çözebilen ancak çeşitli plazmin inhibitörleri tarafından hızla inaktive edilen plazmin gibi fibrinolitik enzimleri (FE) de içeren başka bir klinik trombolitik ilaç türüdür5. Daha sonra, sadece plazminojeni plazmine aktive etmekle kalmayıp, aynı zamanda eski fıstık solucanı Sipunculus nudus'tan (sFE) 6 fibrinolitik enzim olan fibrinidoğrudan parçalayarak trombüsü çözebilen yeni bir fibrinolitik ajan türü bildirilmiştir. Bu çift fonksiyonlu sFE'ye geleneksel trombolitik ilaçlara göre, özellikle anormal plazminojen durumu açısından başka avantajlar sağlar. Diğer iki fonksiyonlu fibrinolitik ajanlarla karşılaştırıldığında 7,8,9, sFE, özellikle oral ilaçlar için, ilaç geliştirme için gıda dışı türetilmiş ajanlara göre güvenlik de dahil olmak üzere çeşitli avantajlar göstermektedir. Bunun nedeni, Sipunculus nudus'un biyogüvenliği ve biyouyumluluğunun iyi kurulmuş olmasıdır10.
Mikroorganizmalardan, solucanlardan ve mantarlardan izole edilen diğer doğal fibrinolitik ajanlara benzer şekilde, sFE'nin S. nudus'tan saflaştırılması çok karmaşıktır ve doku homojenizasyonu, amonyum sülfat çökeltmesi, tuzdan arındırma, anyon değişim kromatografisi, hidrofobik etkileşim kromatografisi ve moleküler eleme gibi çoklu aşamaları içerir10,11,12. Böyle bir saflaştırma sistemi sadece yetkin becerilere ve pahalı malzemelere bağlı değildir, aynı zamanda tüm prosedürü tamamlamak için birkaç gün gerektirir. Bu nedenle, sFE'nin basit bir saflaştırma programı, sFE'nin daha da geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Neyse ki, iki kristal sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) başarıyla elde edilmiştir (bkz. Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2). Yapısal analiz ve moleküler yerleştirme deneyleri sayesinde, sFE'nin katalitik çekirdeğinin özellikle arginin veya lizin kalıntıları içeren hedeflere bağlanabileceğini bulduk.
Burada, sFE'nin kristal yapısına dayanan ilk kez bir afinite arıtma sistemi önerilmiştir. Bu protokolü izleyerek, son derece saf ve oldukça aktif sFE, tek bir afinite saflaştırma aşamasında ham ekstraktlardan saflaştırılabilir. Burada geliştirilen protokol sadece sFE'nin büyük ölçekli hazırlanması için önemli değildir, aynı zamanda diğer fibrinolitik ajanların saflaştırılması için de uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose G-10</td>
			<td>Biowest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium sulfate</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arginine-Sepharose 4B</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Arginine-agarose matrix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromoxylenol Blue (BPB)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Silver Stain Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinase</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysine-Sepharose 4B</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>Lysine-agarose matrix</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#39;,N&#39;-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Color Protein Marker (10-170 kD)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>SINOPHARM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT Aprotein Purification System pure</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750</td>
			<td>SANYO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence Imaging System</td>
			<td>GE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Flow Pump BT-100</td>
			<td>QITE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant Temperature Incubator</td>
			<td>JINGHONG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD</td>
			<td>SENXIN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric Glass Homogenizer DY89-II</td>
			<td>SCIENTZ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Analytical Balance</td>
			<td>DENVER</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12</td>
			<td>SENXIN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal Decolorization Shaker</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Machine AF 103</td>
			<td>Scotsman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KQ-500E Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>ShuMei</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Zhi wei</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W</td>
			<td>Cence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Oven</td>
			<td>Galanz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Reference</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Desktop pH Meter</td>
			<td>Sartorious</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small-sized Vortex Oscillator</td>
			<td>Kylin-Bell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Electrophoresis System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumable Material&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L PCR Tube (200 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (1.5 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (5 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (50 mL)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tube (7 mL)</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Dish (60 mm)</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Membrane (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millex GP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (1 mL )</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (10 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tip (200 &#181;L)</td>
			<td>Axygene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Special Indicator Paper</td>
			<td>TZAKZY</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Universal pH Indicator</td>
			<td>SSS Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity purification of a fibrinolytic enzyme from sipunculus nudus

Sipunculus nudus'un (sFE) fibrinolitik enzimi, hem plazminojeni plazmine aktive edebilen hem de fibrini doğrudan parçalayabilen, geleneksel trombolitik ajanlara göre büyük avantajlar gösteren yeni bir fibrinolitik ajandır. Bununla birlikte, yapısal bilgi eksikliği nedeniyle, sFE için tüm saflaştırma programları, çok karmaşık ve maliyetli olan çok adımlı kromatografi saflaştırmalarına dayanmaktadır. Burada, sFE'nin kristal yapısına dayanan ilk kez sFE'nin bir afinite saflaştırma protokolü geliştirilmiştir; ham numunenin hazırlanmasını ve lizin/arginin-agaroz matrisi afinite kromatografisi kolonunu, afinite saflaştırmasını ve saflaştırılmış sFE'nin karakterizasyonunu içerir. Bu protokolü takiben, bir grup sFE 1 gün içinde saflaştırılabilir. Ayrıca, saflaştırılmış sFE'nin saflığı ve aktivitesi sırasıyla% 92 ve 19.200 U / mL'ye yükselir. Bu nedenle, bu sFE saflaştırması için basit, ucuz ve verimli bir yaklaşımdır. Bu protokolün geliştirilmesi, sFE ve diğer benzer ajanların daha fazla kullanımı için büyük önem taşımaktadır.

Thrombosis is a major threat to public health, especially following the Covid-19 global pandemic1,2. Clinically, many plasminogen activators (PAs), such as tissue-type plasminogen activator (tPA) and urokinase (UK), have been widely used as thrombolytic drugs. PAs can activate patients&#39; plasminogen into active plasmin to degrade fibrin. Thus, their thrombolytic efficiency is heavily restricted by the patients&#39; plasminogen status3,4. Fibrinolytic agents, such as metalloproteinase plasmin and serine plasmin, are another type of clinical thrombolytic drug that also include fibrinolytic enzymes (FE) such as plasmin, which can dissolve clots directly but are quickly inactivated by various plasmin inhibitors5. Subsequently, a novel type of fibrinolytic agent has been reported that can dissolve the thrombus by not only activating the plasminogen into plasmin but also degrading the fibrin directly6-the fibrinolytic enzyme from the ancient peanut worm Sipunculus nudus (sFE)6. This bifunction endows sFE other advantages over traditional thrombolytic drugs, especially in terms of abnormal plasminogen status. Compared with other bifunctional fibrinolytic agents7,8,9, sFE displays several advantages, including safety, over non-food derived agents for drug development, especially for oral drugs. This is because the biosafety and biocompatibility of Sipunculus nudus have been well-established10.
Similar to the other natural fibrinolytic agents isolated from microorganisms, earthworms, and mushrooms, the purification of sFE from S. nudus is very complicated and includes multiple stages, such as tissue homogenization, ammonium sulphate precipitation, desalination, anion-exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and molecular sieving10,11,12. Such a purification system not only depends on proficient skills and expensive materials, but also requires several days to complete the whole procedure. Therefore, a simple purification program of sFE is of great significance for the further development of sFE. Fortunately, two crystals of sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) have been successfully obtained (see Supplemental File 1 and Supplemental File 2). Through structural analysis and molecular docking experiments, we found that the catalytic core of sFE could specifically bind to targets containing arginine or lysine residues.
Herein, an affinity purification system was proposed for the first time, based on the crystal structure of sFE. By following this protocol, highly pure and highly active sFE could be purified from the crude extracts in a single affinity purification stage. The protocol developed here is not only important for the large scale preparation of sFE, but also may be applied for the purification of other fibrinolytic agents.

Yazar Spotlight: Sipunculus nudus'tan Fibrinolitik Bir Enzimin Afinite Saflaştırılması  

Sipunculus nudus'tan Bir Fibrinolitik Enzimin Afinite Saflaştırılması

Our research is mainly about the purification of fibrinolytic enzyme. This work tries to establish a simple purification method for fibrinolytic enzyme. In this work, we report an arginine or lysine best-affinity purification system of fibrinolytic enzyme for the first time.Compared with the conventional purification methods, this is a simple, inexpensive, and efficient approach for the purification of fibrinolytic enzymes from Sipunculus nudus. The development of this protocol is of greater significance for the further utilization of fibrinolytic enzymes from Sipunculus nudus and other similar agents.

Bu protokolü takiben, ham doku lizatları ekstrakte edildi, arginin-agaroz matriksi ve lizin-agaroz matriks afinite kromatografisi kolonları oluşturuldu, saflaştırılmış sFE elde edildi ve saflaştırılmış sFE'nin saflığı ve fibrinolitik aktivitesi sırasıyla SDS-PAGE ve fibrin plakaları ile ölçüldü.
Santrifüjlemeden sonra, toplanan süpernatant şeffaf bronz viskoz bir sıvıydı. Yağış, bu süpernatant doymuş amonyum sülfat çözeltisi (dokuz hacim) ile karıştırı...

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus at JoVE.com

Burada, Sipunculus nudus'tan fibrinolitik bir enzimin basit, ucuz ve verimli bir afinite saflaştırma yöntemi sunuyoruz.

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...

Araştırmamız esas olarak fibrinolitik enzimin saflaştırılması ile ilgilidir. Bu çalışma, fibrinolitik enzim için basit bir saflaştırma yöntemi oluşturmaya çalışmaktadır. Bu çalışmada, fibrinolitik enzimin arginin veya lizin en iyi afiniteli saflaştırma sistemini ilk kez sunuyoruz.Geleneksel saflaştırma yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu, fibrinolitik enzimlerin Sipunculus nudus'tan saflaştırılması için basit, ucuz ve etkili bir yaklaşımdır. Bu protokolün geliştirilmesi, Sipunculus nudus ve diğer benzer ajanlardan fibrinolitik enzimlerin daha fazla kullanılması için daha büyük önem taşımaktadır.

affinity-purification-of-a-fibrinolytic-enzyme-from-sipunculus-nudus

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

1.2K Görüntüleme.  Huaqiao University. Araştırmamız esas olarak fibrinolitik enzimin saflaştırılması ile ilgilidir. Bu çalışma, fibrinolitik enzim için basit bir saflaştırma yöntemi oluşturmaya çalışmaktadır. Bu çalışmada, fibrinolitik enzimin arginin veya lizin en iyi afiniteli saflaştırma sistemini ilk kez sunuyoruz.Geleneksel saflaştırma yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu, fibrinolitik enzimlerin Sipunculus nudus'tan saflaştırılması için basit, ucuz ve etkili bir yaklaşımdır...

Video: Yazar Spotlight: Sipunculus nudus'tan Fibrinolitik Bir Enzimin Afinite Saflaştırılması  

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin directly, showing great advantages over traditional thrombolytic agents. However, due to the lack of structural information, all the purification programs for sFE are based on multistep chromatography purifications, which are too complicated and costly. Here, an affinity purification protocol of sFE is developed for the first time based on a crystal structure of sFE; it includes preparation of the crude sample and the lysine/arginine-agarose matrix affinity chromatography column, affinity purification, and characterization of the purified sFE. Following this protocol, a batch of sFE can be purified within 1 day. Moreover, the purity and activity of the purified sFE increases to 92% and&#160;19,200 U/mL,&#160;respectively. Thus, this is a simple, inexpensive, and efficient approach for sFE purification. The development of this protocol is of great significance for the further utilization of sFE and other similar agents.

Here, we present an affinity purification method of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus that is simple, inexpensive, and efficient.

Biyokimya

Protein Isolation from Sipunculus nudus

Protein Isolation from Sipunculus nudus  

Begin the sample treatment by dissecting 100 grams of fresh Sipunculus nudus and collecting their intestine and inner fluid.Add 300 milliliters of Tris hydrochloride buffer and homogenize at 1000 RPM for 60 seconds.Freeze thaw the homogenate three times.After centrifuging the freeze thawed homogenate, collect the supernatant and store it at 4

Sipunculus nudus'tan Protein İzolasyonu

Affinity Chromatography Mediated Fibrinolytic Enzymes Purification from Crude Protein Extracts 

Filter the crude proteins extracted from the Sipunculus nudus intestine through a 0.22-micrometer filter membrane. Store this sample at four degrees Celsius for later use. Pack the arginine agarose matrix affinity chromatography column by loading the arginine agarose matrix medium into a five-milliliter empty chromatography column.Similarly, load the lysine agarose matrix affinity chromatography column by loading the lysine agarose matrix medium into an empty chromatography column. Equilibrate the affinity chromatography columns with double-distilled water followed by tris hydrochloride buffer. Load the filtered protein sample onto the pre-equilibrated column.Wash the column with five volumes of 0.02-molar tris hydrochloride buffer before eluting it with 0.15-0.25-0.35-0.45-0.55-and 0.65-molar sodium chloride solutions, successively. Once the elution peak appears in the 0.15-molar sodium chloride elution, collect the fractions in five-milliliter tubes. Concentrate the elution sample using a three-kilodalton ultracentrifugal filter and store this sample at minus 80 degrees Celsius for later use.When the protein solution was loaded onto the arginine agarose matrix affinity column, the flow-through peak appeared from approximately 40 to 66 minutes. In the gradient elution stage, elution with 0.15-molar sodium chloride peaked from approximately 94 to 110 minutes. When the protein solution was loaded to the lysine agarose matrix affinity column, the flow-through peak appeared from approximately 38 to 60 minutes.In the gradient elution stage, elution with 0.15-molar sodium chloride peaked from 80 to 86 minutes.

Afinite Kromatografisi Aracılı Fibrinolitik Enzimler Ham Protein Ekstraktlarından Saflaştırma 

Fibrinolytic Activity of the Fibrinolytic Enzyme Purified from Sipunculus nudus

Fibrinolytic Activity of the Fibrinolytic Enzyme Purified from  Sipunculus nudus  

Begin the fibrin plate preparation by mixing 25 milligrams of fibrinogen with 1.25 milliliters of physiological saline. Next, prepare the thrombin solution by thoroughly mixing 100 units of thrombin with 1.05 milliliters of physiological saline. Then, prepare the agarose solution by adding 0.5 grams of agarose to 22.5 milliliters of 0.02 molar Tris-hydrochloride acid buffer.Heat the agarose solution at 100 degrees Celsius until it dissolves completely. Cool the agarose solution to around 50 degrees Celsius before adding the fibrinogen solution to it. Immediately add the thrombin solution, mix rapidly, and pour the mixture into a 60-millimeter culture dish.To load the sample, punch three-millimeter wells into the fibrin plates using a sterile Boer, and fill them with 10 microliters of samples. Incubate the plates at 37 degrees Celsius for 18 hours before measuring the size of their degrading zones and calculating the fibrinolytic activity. Fibrinolytic activity evaluation showed a 1.3-centimeter lysing zone in the urokinase control, no lysing zone in the physiological saline buffer, 2.1 centimeters of the lysing zone in the crude protein well, and 1.8 centimeters diameter of the lysing zone in the purified fibrinolytic enzyme well.