Massachusetts General Hospital'daki HSCI-CRM Akış Sitometrisi tesisi ve Harvard Üniversitesi'ndeki Bauer Core Tesisi tarafından uzman teknik yardımla desteklendik. T.K ve K. G, İsveç Araştırma Konseyi ve C.M. Alman Araştırma Vakfı tarafından desteklendi. Tek hücreli RNA dizileme verilerinin analizindeki yardımları için Sergey Isaev ve I-Hsiu Lee'ye teşekkür ederiz.

İnsan dokusu ile yapılan tüm çalışmalar, Massachusetts General Hospital Dahili İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandıktan sonra gerçekleştirildi. Tüm hayvan prosedürleri, Massachusetts General Hospital Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak yürütüldü. Bu çalışma için 8-10 haftalık ve hem erkek hem de dişi C57Bl / 6 fareleri kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.
1. Murin timik dokusunun hazırlanması
<ol><li>Aşağıdaki tamponları ve çözeltileri hazırlayın.<ol><li>% 2 (h / h) fetal sığır serumu (FBS) ile orta 199 (M199) (bkz.</li>
		<li>Murin ayrışma kokteyli: M199 +% 2 FBS'de 0.5 WU / mL Liberaz TM ve 6.3 U / mL DNaz I (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
		<li>% 2 (a / h) Sığır serum albümini (BSA) ile M199. NOT: FBS içeren ortam, RNA kalitesini artırmak için BSA'ya geçirilebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Murin timus diseksiyonunu gerçekleştirin<ol><li>Fareyi CO2 boğulması ile ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) ve sırt üstü yatırın. % 70 etanol püskürterek göğsün üzerindeki kürkü ıslatın ve göğüs boşluğunu açmaya devam edin.</li>
		<li>Önce cerrahi makasla göğüs kafesinin hemen altında enine bir kesi yaparak timusu dikkatlice inceleyin. Farenin her iki yanındaki kaburgaları köprücük kemiğine kadar kesin. Daha sonra diyaframı göğüs duvarının serbest bırakılabilmesi için kesin. Göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için kaburgaları bir çift forseps ile kaldırın.<ol><li>Timus, boşluğun tepesinde, kalbin hemen üzerinde oturan beyaz, bilobular bir organdır. Timusu forseps ile tutun ve timusu yerinde tutan bağ dokusunu nazikçe kesin. Diseke timik dokuyu buz üzerinde M199 +% 2 FBS ile 6 oyuklu bir plakanın kuyusuna koyun. NOT: Yaşlı veya radyasyonla şartlandırılmış fareler veya timik kusurları olan mutant suşlarla çalışırken, timus o kadar küçük olabilir ki, organı güvenilir bir şekilde çıkarmak için bir diseksiyon mikroskobu gerekir.</li>
		</ol></li>
		<li>Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, künt uçlu forseps ve mikro yaylı makas kullanarak herhangi bir ekstratimik dokuyu çıkarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Murin timik dokusunun enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin (10 dakikalık artışlarla 30 dakika)<ol><li>Temizlenmiş timusu 15 mL'lik bir tüpün kapağına yerleştirin ve dokuyu steril cerrahi makasla ince ince kıyın. NOT: Sindirim için kullanılacak olan tüpün kapağındaki dokunun kıyılması, bir kaptan diğerine geçişe bağlı doku kaybını en aza indirir. Bu, yaşlı veya radyasyonla şartlandırılmış fareler veya timik kusurları olan mutant suşlarla çalışırken çok önemlidir. Bu ortamlardaki küçük timus boyutu, mümkün olan her yerde malzeme kaybını azaltma ihtiyacını gerektirir.</li>
		<li>15 mL'lik tüpe 2 mL murin ayrışma kokteyli ekleyin, timus parçalarını içeren kapağı takın ve dokunun ayrışma kokteylinde yeniden süspanse edilmesini sağlamak için 5 kez ters çevirin.</li>
		<li>Sızıntıyı önlemek için, tüpün kapağını parafin filme sarın. Ardından tüpü 250 rpm çalkalama ile 37 ° C'lik bir su banyosuna yatay olarak yerleştirin. 10 dakika inkübe edin. NOT: Sindirim protokolünün başarısı, inkübasyonun 37 °C'de ve çalkalama ile yapılmasına bağlıdır. Açıklanan protokol, çalkalanan bir su banyosu kullanılarak optimize edilmiştir. Bu mevcut değilse, ısıtılmış bir ortamda ajitasyonu etkinleştiren diğer yaklaşımlar işe yarayabilir, ancak protokolün önce bu ayarlar için optimize edilmesini öneririz.</li>
		<li>15 mL'lik tüpü bir rafa yerleştirin ve doku parçalarının oturmasına izin verin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve 70 μm'lik bir hücre süzgecinden buz gibi 50 ml'lik bir tüpe geçirin.</li>
		<li>Toplam 3 tur sindirim için 2-4 arasındaki adımları iki kez tekrarlayın. Doku, son inkübasyonun sonunda az ya da çok tamamen ayrışmalıdır.</li>
		<li>Toplanan hücre süspansiyonuna 20 mL M199 +% 2 FBS ekleyin. 500 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da döndürün.</li>
		<li>Süpernatanı çıkarın ve uygun bir M199 +% 2 FBS hacminde yeniden süspanse edin. Ardından hücre sayımına devam edin. NOT: M199 +% 2 FBS'nin yeniden süspanse edilmesi gereken hacim, timusun durumuna bağlı olacaktır. 6-10 haftalık fareler için, dokuyu 3-4 mL M199 +% 2 FBS içinde yeniden süspanse etmenizi öneririz. Bununla birlikte, yaşlı veya radyasyonla şartlandırılmış doku veya timik kusurlu mutant suşlar kullanan deneyler için, küçük timus boyutu 0.1-1 mL arasında değişen daha düşük hacimler gerektirecektir.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu %0,4 (a/h) tripan mavisi çözeltisinde 1:2 oranında seyrelterek hücreleri sayın. Hücreleri bir hemositometreye yükleyin ve parlak alan mikroskobu altında sayın. Mililitre başına canlı hücre sayısını belirlemek için boyanmamış hücreleri ve numune canlılığını değerlendirmek için mavi lekeli hücre sayısını sayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Murin timik stromanın floresanla aktive edilmiş hücre sıralamasını gerçekleştirin<ol><li>Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün. 25 U / mL Koruyucu RNaz inhibitörü ile desteklenmiş M199 +% 2 FBS'de 5 x 107 hücre / mL konsantrasyonda hücreleri yeniden süspanse edin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
		<li>2 μg/mL konsantrasyonda murin Fc Bloğu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Hücreleri aşağıdaki antikorlarla boyayın: CD45-PE / Cy7 (4 μg / mL), Ter119-PE (4 μg / mL), CD31-BUV737 (2 μg / mL) ve EpCam-BV711 (2 μg / mL) (Malzeme Tablosuna bakınız) 4 ° C'de 30 dakika boyunca.</li>
		<li>Numuneleri M199 + %2 BSA'da yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün.</li>
		<li>DAPI (0.5 μg/mL) veya 7-AAD (1 μg/mL) gibi bir canlılık boyası içeren M199 + %2 BSA'daki süpernatanı çıkarın ve hücreleri yeniden süspanse edin (bkz. Belirlenen protokolleri takip ederek timik stromal hücrelerin FACS izolasyonuna geçin19.</li>
	</ol></li>
</ol>2. İnsan timik dokusunun hazırlanması
<ol><li>Aşağıdaki tamponları ve çözeltileri hazırlayın.<ol><li>Orta 199 (M199) ve %2 (h/h) FBS.</li>
		<li>%1,5 (a/h) BSA ile M199.</li>
		<li>İnsan ayrışma kokteyli: M199 +% 1.5 BSA'da 1 mg / ml Kollajenaz IV ve 2 mg / mL Dispas ve 6.3 U / mL DNaz I (Malzeme Tablosuna bakınız). NOT: İnsan timik dokusunun hazırlanmasındaki son sindirim adımı tripsin içerir. Bu nedenle, FBS tripsin aktivitesini inhibe edeceğinden, bu noktaya kadar olan tüm adımların BSA içeren tamponda gerçekleştirilmesi önemlidir.</li>
	</ol></li>
	<li>İnsan timik doku izolasyonu gerçekleştirin<ol><li>İnsan timusunu (daha önce yayınlanmış yöntem19'a göre toplanan) uygun bir hacimde M199 +% 1.5 BSA'ya yerleştirin ve işleme başlayana kadar buz üzerinde saklayın.</li>
		<li>İnsan timik dokusu ile çalışırken, işi bir doku kültürü başlığında gerçekleştirerek ve CDC yönergelerine göre standart önlemleri kullanarak potansiyel olarak bulaşıcıymış gibi ele alın20.</li>
		<li>Dokuyu 10 mL buz gibi M199 +% 1.5 BSA içeren 10 cm'lik bir Petri kabına koyun. Steril forseps ve makas kullanarak, organ çıkarılırken hasar gören ekstratimik yağ veya dokuyu dikkatlice temizleyin.</li>
		<li>Cerrahi makas ve bir çift forseps kullanarak, timusu 1 cm3 küp halinde kesin ve parçaları hafifçe aşağı itmek için 10 mL'lik bir şırınganın pistonunu kullanın. Bu, gelişmekte olan timositlerin bir kısmını serbest bırakacak ve böylece sindirilecek doku hacmini azaltacaktır. NOT: Timosit gelişim aşamalarının daha sonraki analizine ihtiyaç duyulursa, salınan hematopoietik fraksiyonu kaydedin. Bununla birlikte, bu fraksiyonu enzimatik sindirim sırasında üretilen stromal hücre fraksiyonu ile birleştirmeyin. İki fraksiyonun bir araya getirilmesinin, hücre süspansiyonunda tıkanma oluşma riskini önemli ölçüde artırdığı ve sonuçta stromal hücrelerin verimini azalttığı gözlendi. Dokunun nazikçe ezilmesi sırasında çok az stromal hücre kaybolur.</li>
	</ol></li>
	<li>İnsan timik dokusunun enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin (30 dakikalık artışlarla 90 dakika)<ol><li>Hafifçe ezilmiş timik doku parçalarının yaklaşık 5 mg'ını 50 mL'lik konik bir tüpün kapağına aktarın. Daha sonra steril cerrahi makas kullanarak dokuyu ince bir şekilde kesin.</li>
		<li>8 mL insan ayrışma kokteylini 50 mL'lik tüpe pipetleyin, kıyılmış insan timik dokusunu içeren kapağı takın ve ardından tüm dokunun enzim kokteyli ile karıştığından emin olmak için tüpü 5 kez hafifçe ters çevirin.</li>
		<li>Sızıntıyı önlemek için tüpün kapağını parafin film ile sabitleyin. Tüpü 37 ° C'de 30 dakika boyunca sallanan (250 rpm) bir su banyosunda yatay olarak inkübe edin.</li>
		<li>50 mL'lik tüpü bir rafa yerleştirin ve süpernatanı çıkarmadan ve 70 μm'lik bir hücre süzgecinden buz üzerine yerleştirilmiş 50 ml'lik yeni bir tüpe geçirmeden önce insan timik doku parçalarının çökelmesine izin verin.</li>
		<li>İnsan ayrışma kokteyli ile toplam iki tur sindirim için 2.3.2-1.3.4 adımlarını tekrarlayın.</li>
		<li>İkinci sindirim turu yapıldıktan sonra, kalan dokuya 8 mL daha insan ayrışma kokteyli ekleyin. Daha sonra 2 mL% 0.25 tripsin pipetleyin doku ayrışma tüpüne. 37 °C'de 30 dakika daha inkübe edin, 250 rpm'de çalkalayın. NOT: İnsan dokusu için sindirim süresinin en az 90 dakika olması kesinlikle önemlidir, çünkü daha kısa inkübasyon süreleri stromal hücre verimlerinin büyük ölçüde azalmasına neden olur.</li>
		<li>Son inkübasyon adımı yapıldıktan sonra, hücre süspansiyonunu ve kalan doku parçalarını, 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek önceki adımlarda toplanan süpernatan ile birleştirin. Tripsin reaksiyonunu kırmak için numuneye 3 mL FBS ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin.</li>
		<li>Adım 1.3'te açıklandığı gibi hücreleri saymaya devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>İnsan timik stromasının floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırmasını gerçekleştirin<ol><li>İnsan timusunun hücre süspansiyonunu aşağı çevirin ve 25 U / mL Koruyucu RNaz inhibitörü ile desteklenmiş M199 +% 2 FBS'de 5 x 107 hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspansiyon haline getirin.</li>
		<li>İnsan Fc Bloğu (5 μg/mL) ile 4 °C'de 10 dakika inkübe edin.</li>
		<li>CD45-BV711 (2,5 μg/mL), CD235a-BV711 (2,5 μg/mL), Lineage-cocktail-FITC (3,76 μg/mL), CD66b-FITC (20 μL/100 μL numune), CD8-APC/Cy7 (5 μL/100 μL numune), CD4-BV605 (5 μL/100 μL numune), CD31-PE/Dazzle594 (10 μg/mL) ve EpCam-BV421 (2,5 μg/mL) ile 4 ° C'de 30 dakika boyayın (bkz.</li>
		<li>Numuneleri M199 + %1,5 BSA'da yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün.</li>
		<li>DAPI (0.5 μg/mL) veya 7-AAD (1 μg/mL) gibi bir canlılık boyası içeren M199 +% 1.5 BSA'daki süpernatanı çıkarın ve hücreleri yeniden süspanse edin. Belirlenen protokolleri takip ederek timik stromal hücrelerin FACS izolasyonuna geçin19.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Murin kemiği ve kemik iliği dokusunun hazırlanması
NOT: Kemik ve kemik iliği fraksiyonları, stromal hücrelerin maksimum saflığını ve dokuların optimal ayrışmasını elde etmek için iki ayrı sindirim reaksiyonunda hazırlanır. Numuneler, sindirim adımlarından sonra tek bir stromal bölme olarak sıralanmak üzere bir araya getirilebilir.
<ol><li>Aşağıdaki tamponları ve çözeltileri hazırlayın.<ol><li>%2 (h/h) FBS ile M199.</li>
		<li>Murin B&M (kemik ve ilik) ayrışma kokteyli: M199 +%2 FBS'de Stemxyme 2 mg/mL, Dispase 1 mg/mL ve 10 U/mL DNaz I ( Malzeme Tablosuna bakınız). NOT: B&M ayrışma karışımını taze hazırlayın ve kullanana kadar karışımı buz üzerinde tutun.</li>
		<li>%0,5 (a/h) BSA ile M199.</li>
		<li>% 0,5 (a / h) BSA ile fosfat tamponlu salin (PBS).</li>
		<li>% 2 (a / h) Sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA ile M199. NOT: FBS içeren ortam, RNA kalitesini artırmak için BSA'ya geçirilebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Murin kemik iliği ayırma işlemi gerçekleştirin<ol><li>Fareyi CO2 boğulması ile ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Kürkü ıslatmak için% 70 etanol püskürtün.</li>
		<li>Femur, tibia, pelvis ve humerusu her iki taraftan dikkatlice çıkarın ve buz 21,22 üzerinde M199 +% 2 FBS içeren bir kuyuya yerleştirin.</li>
		<li>Kemiğe verilen zararı en aza indirmek ve periosteal tabakayı korumak için tüm kas, bağ ve kıkırdak dokusunu mendille çıkarın. Buz üzerinde M199 +% 2 FBS ile yeni bir kuyuya yerleştirin.</li>
		<li>Bir neşter kullanın ve epifizi çıkarmak için uzun kemiklerin büyüme plakalarını kesin ve buz üzerinde M199 +% 2 FBS içeren 10 cm'lik bir tabağa koyun.</li>
		<li>Kemik iliğini soluk beyaz olana kadar kemiklerden boşaltın. İliği buz üzerinde 15 mL'lik bir tüpe akıtmak için 28 G'lik bir iğne ve 10 mL M199 +% 2 FBS ile doldurulmuş 10 mL'lik bir şırınga kullanın. Kızarmış kemiği epifizle birlikte 10 cm'lik tabağa yerleştirin. NOT: Dokuların tamamen ayrılması için kemik iliğinin tamamen yıkanması, daha iyi numune hazırlanmasına neden olacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>Murin kemik iliği dokusunun enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin (10 dakikalık artışlarla toplam 30 dakika)<ol><li>15 mL'lik tüpü, ilik tüpün dibine batana kadar buz üzerinde dik olarak bırakın. 10 mL M199 +% 2 FBS'yi pipetleyerek yavaşça çıkarın.</li>
		<li>15 mL'lik tüpe 4 mL B&M ayrışma kokteyli ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna (sallama yok) koyun.</li>
		<li>5 dakika sonra tüpü üç kez ters çevirin ve tekrar su banyosuna yerleştirin.</li>
		<li>İlk 10 dakikadan sonra, peletin altta olduğundan emin olun ve 70 μm'lik bir hücre süzgecinden buz gibi 50 mL'lik bir tüpe süzerken süpernatanı toplayın. Kalan BM peletine 2 mL taze B&M ayrışma kokteyli ekleyin ve tekrar su banyosuna koyun.</li>
		<li>Kalan kemik iliği parçalarını 1 mL'lik bir pipet kullanarak kuvvetli pipetleme ile ayırın. Elde edilen tüm hücre süspansiyonunu önceki adımlarda olduğu gibi aynı tüpte toplayın. Toplanan hücre süspansiyonuna 20 mL M199 +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA ekleyin. NOT: Adım 3.3.5'te, son sindirilen numuneden sonra eklenen tampon, daha fazla enzimatik aktiviteyi inhibe etmeye yardımcı olmak için EDTA içerir.</li>
	</ol></li>
	<li>Murin kemik iliği dokusunun hematopoietik hücre tükenmesini gerçekleştirin.<ol><li>Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. CD45, Ter119, CD11b, Gr1, B220 ve CD3'ü hedefleyen biyotin antikorları (5 mg / mL) ile 500 μL PBS +% 0.5 BSA'da yeniden süspansiyon yapın (bkz. Kapaklı yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.</li>
		<li>Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.</li>
		<li>Manyetik boncukları iyice vorteksleyin ve tüpe 25 μL manyetik boncuk ekleyin.</li>
		<li>Karanlıkta oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.</li>
		<li>Tüpü 2-3 dakika boyunca eşleşen mıknatısa yerleştirin ve süpernatanı yeni bir tüpte toplayın. NOT: Bu adımdan sonra kemik iliği bir havuzda toplanabilir veya kemik fraksiyonundan ayrı tutulabilir. Soy tükenmesi başarılı olursa, ortaya çıkan hücre süspansiyonu kırmızı hücrelerden yoksun olmalıdır.</li>
	</ol></li>
	<li>Murin kemik dokusunun enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin.<ol><li>50 mL'lik bir tüpün düz kapak ucu ile 10 cm'lik tabakta kemikleri daha küçük parçalara ayırın. Filtrenin içindeki kemik parçalarını izole etmek için süpernatanı 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün. NOT: Alternatif olarak, kemik parçalanması için bir havan ve havan tokmağı kullanılabilir. Bununla birlikte, bu seçenek, kemik kırılmak yerine topraklandığında daha fazla döküntü ve daha düşük stromal hücre canlılığı üretme eğilimindedir. Stroma hücreleri hala kemiğe ve kemiğe yapışıktır ve hematopoietik hücreleri içeren süpernatan atılmalıdır.</li>
		<li>Hücre süzgecindeki kemik parçalarını kesmek için makas kullanın. Bu, daha verimli bir enzimatik ayrışma için yüzey alanını artıracaktır. Kemiği 5 mL M199 +% 2 FBS ile yıkayın.</li>
		<li>Kemik fraksiyonunu 5 mL murin B&M ayrışmasına yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız) yeni bir 50 mL tüpte karıştırın.</li>
		<li>Sızıntıyı önlemek için, tüpün kapağını parafin filme sarın. Ardından tüpü yatay olarak 37 °C'lik bir su banyosuna 120 rpm ile 30 dakika çalkalayarak yerleştirin.</li>
		<li>Sindirimden sonra, 25 mL M199 +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA ekleyin ve stromal hücreleri içeren süpernatanı 70 μm'lik bir hücre süzgecinden buz gibi 50 ml'lik bir tüpe süzün. NOT: Ortaya çıkan kemik parçalarının sindirim yoluyla gözle görülür şekilde azaldığını kontrol edin. Adım 3.5.5'te, son sindirilen numuneden sonra eklenen tampon, daha fazla enzimatik aktiviteyi inhibe etmeye yardımcı olmak için EDTA içerir.</li>
	</ol></li>
	<li>Murin kemiği ve kemik iliği stromasının floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırmasını gerçekleştirin.<ol><li>Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün.</li>
		<li>PBS +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA'da 10 μg / mL konsantrasyonda murin Fc Bloğunda yeniden süspansiyon yapın ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Hücreleri (10 milyon hücre / 100 μL toplam boyama hacmine kadar) aşağıdaki antikorlarla boyayın: CD45-PE / Cy7 (1 μg / mL), Ter119-PE / Cy7 (1 μg / mL), CD31-BV421 (0.66 μg / mL), CD140a-APC (2 μg / mL), Sca1-AF700 (0.66 μg / mL), CD51-PE (2 μg / mL), CD105-PE / göz kamaştırıcı (2 μg / mL) (bkz.</li>
		<li>Calcein-'yi oda sıcaklığına dengelemeye bırakın ve 50 μL DMSO'da yeniden süspanse edin. Her kullanım için taze olarak hazırlayın. Yeniden süspansiyondan sonra oda sıcaklığında tutun. Antikor boyama kokteylinde zaten yeniden süspanse edilmiş olan numuneye (20 μg / mL) eklemeden önce kalseini PBS (0.1 mg / mL) içinde önceden seyreltin ve karanlıkta 4 ° C'de 20-30 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Numuneleri PBS +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA'da yıkayın ve 500 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.</li>
		<li>Süpernatanı çıkarın ve PBS +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA'daki hücreleri yeniden süspanse edin. Belirlenen protokolleri takip ederek kemik ve kemik iliği stromal hücrelerinin FACS izolasyonuna geçin19.</li>
	</ol></li>
</ol>

Timus ve Kemik İliğinden Stromal Hücre İzolasyonunun Optimize Edilmesi

<ol>
	<li>Baryawno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+taxonomy+of+the+bone+marrow+stroma+in+homeostasis+and+leukemia.">A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia.</a> Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).</li><li>Severe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+changes+in+bone+marrow+stromal+cell+populations+revealed+through+single-cell+protein+expression+mapping.">Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).</li><li>Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+2020+view+of+thymus+stromal+cells+in+t+cell+development.">A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development.</a> J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).</li><li>Park, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+atlas+of+human+thymic+development+defines+t+cell+repertoire+formation.">A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation.</a> Science. 367 (6480), (2020).</li><li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+rna-seq+workflows.">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).</li><li>Lischetti, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+thresholding+and+tissue+dissociation+optimization+for+cite-seq+identifies+differential+surface+protein+abundance+in+metastatic+melanoma.">Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma.</a> Commun Biol. 6 (1), 830 (2023).</li><li>Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+and+perivascular+cells+maintain+haematopoietic+stem+cells.">Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells.</a> Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).</li><li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche.">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li><li>Raaijmakers, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=progenitor+dysfunction+induces+myelodysplasia+and+secondary+leukaemia.">progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia.</a> Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).</li><li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+bone+marrow+sources+of+pleiotrophin+control+hematopoietic+stem+cell+maintenance+and+regeneration.">Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).</li><li>Zhou, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+adipocytes+promote+the+regeneration+of+stem+cells+and+haematopoiesis+by+secreting+scf.">marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf.</a> Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).</li><li>Steinmann, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+the+human+thymus+during+aging.">Changes in the human thymus during aging.</a> Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).</li><li>Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+involution+of+the+ageing+human+thymic+epithelium+is+independent+of+puberty.+A+morphometric+study.">The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study.</a> Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).</li><li>Ambrosi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+accumulation+in+the+bone+marrow+during+obesity+and+aging+impairs+stem+cell-based+hematopoietic+and+bone+regeneration.">Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).</li><li>Ho, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+bone+marrow+hematopoietic+stem+cell+niches+promotes+myeloid+cell+expansion+during+premature+or+physiological+aging.">Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging.</a> Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).</li><li>Kusumbe, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-dependent+modulation+of+vascular+niches+for+haematopoietic+stem+cells.">Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).</li><li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium.">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).</li><li>Stoeckle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+myeloid+dendritic+cells+and+epithelial+cells+from+human+thymus.">Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus.</a> J Vis Exp. (79), e50951 (2013).</li><li>Gustafsson, K., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+thymus+stromal+cells+from+human+and+murine+tissue.">Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue.</a> Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).</li><li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation.">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> J Vis Exp. (110), e53936 (2016).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+compact+bone.">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone.</a> Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).</li><li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche.">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li><li>Kode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukaemogenesis+induced+by+an+activating+beta-catenin+mutation+in+osteoblasts.">Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts.</a> Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).</li><li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+niche-specific+expression+of+cxcl12+controls+quiescence+of+treatment-resistant+leukemia+stem+cells.">Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).</li><li>Duarte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+endosteal+vascular+niche+remodeling+rescues+hematopoietic+stem+cell+loss+in+aml.">Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).</li><li>O'flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+rna-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biol. 20 (1), 210 (2019).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics.">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biol. 19 (1), 224 (2018).</li></ol>

D.T.S., Agios Therapeutics ve Editas Medicines'ın yöneticisi ve hissedarıdır; Magenta Therapeutics ve LifeVault Bio'nun kurucusu, direktörü, hissedarı ve bilimsel danışma kurulu üyesi, Fate Therapeutics ve Garuda Therapeutics'in hissedarı ve kurucusu ve Clear Creek Bio'nun direktörü, kurucusu ve hissedarı, FOG Pharma, Inzen Therapeutics ve VCanBio'nun danışmanı ve Sumitomo Dianippon'dan sponsorlu araştırma fonu alıcısı. D.T.S ve K.G, patent US20220143099A1 mucitleridir.

Hematopoetik organlardaki stromal hücreler normal kan üretimi için kritik öneme sahiptir ve hematopoietik stroma bozulmaları hematopoietik bakımda ve strese yanıtta ciddi bozulmalara neden olabilir 9,23,24. Hematopoietik stromal hücrelere ilişkin içgörü, hematolojik hastalıklarıanlamak 7,9,10,24 ve bunlarla savaşmak için terapötikler geliştirme yeteneğ...

Sağlıklı yetişkinde, de novo kan hücrelerinin üretimi kemik iliğinde ve timusta gerçekleşir. Bu bölgelerdeki stromal hücreler hematopoezin sürdürülmesi için gereklidir, ancak stroma dokunun %1'inden daha azını oluşturur 1,2,3,4. Bu nedenle, stroma'yı destekleyen saf hematopoez izolatlarının elde edilmesi, özellikle yüksek kalitede numuneler elde etmek için uygun işleme gerektiren tek hücreli multiomikler için önemli bir zorluk teşkil eder. Farklı sindirim kokteyllerinin bileşenleri, multiomik analizdeki belirli adımlara müdahale edebilir 5,6. Burada sunulan protokoller, kemik iliği ve timik dokulardan çok çeşitli stromal hücrelerin izolasyonunu detaylandırmaktadır.
Hem kemik iliği hem de timustaki stromal bileşenlerin bozulması, kan hücresi gelişiminde derin bozulmaya neden olur ve malignitelere neden olabilir 7,8,9. Stromayı destekleyen hematopoez, sitotoksik koşullandırma ve kemik iliği transplantasyonunu takiben hasar görür ve bu da hematopoietik kök ve progenitör hücreleri (HSPC'ler) sürdüren sitokinlerin ve büyüme faktörlerinin salgılanmasının azalmasına neden olur2,10,11. Ayrıca, yaşlanma kemik iliği ve timus stromal hücrelerini etkiler ve muhtemelen yaşlı hematopoietik fenotiplere katkıda bulunur. Timus, yaşa bağlı geniş evrim geçiren ilk organdır. Yağ ve fibrotik doku, ergenliğin başlangıcında T hücreli destekleyici stromanın yerini almaya başlar12,13. Kemik iliğinde adiposit içeriği yaşla birlikte artar ve vasküler ve endosteal nişler önemli ölçüde yeniden şekillenir 14,15,16.
Hematopoezi destekleyici stromanın çoklu stres durumlarında ve hem insan hem de murin dokusunun timus durumunda çalışmasını sağlamak için, daha önce yayınlanmış sindirim protokollerinioptimize ettik 1,2,8,17,18. Bu protokoller, hücrelerin verimli ve tekrarlanabilir izolasyonunu sağlar ve tek hücreli RNA dizilimi (scRNAseq) ve diğer multiomik türleri ile uyumludur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200-072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7AAD (7-aminoactinomycin D)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human Lineage Cocktail 3-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>643510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57Bl/6 mice</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>664</td>
			<td>Males or females, 8-12 weeks old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>65-0853-78</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C5138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Sterile Cell Strainers, White, Mesh Size: 70 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>422801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>90083</td>
			<td>&#160;2500 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easysep mouse streptavidin RapidSpheres Isolation kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>19860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A31605-01</td>
			<td>Qualified One Shot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fc Block</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>5401127001</td>
			<td>Research Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD235a-BV77</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>740785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD31-PE/Dazzle594</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>303130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD45-BV77</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD4-BV605</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD66b-FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human CD8-APC/Cy7</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-human EpCam-BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>324220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protector RNase Inhibitor</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>3335402001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>120424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD11b-Biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD140a-APC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-1401-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD31-BUV737</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>612802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD31-BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD3-Biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>100244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45.2-Biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>109804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD45R/B220-Biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse CD51-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse EpCam-BV711</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>563134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)-AF700</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>108404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ter119-Biotin</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ter119-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-mouse Ter119-PE/Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemxyme&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stromal cell isolation from hematopoietic organs

Tek hücre dizilemesi, hematopoietik organların stromasındaki heterojen hücre popülasyonlarının haritalanmasını sağlamıştır. Bu metodolojiler, kararlı durumda daha önce çözülmemiş heterojenliğin yanı sıra, dışsal stresler veya yaşlanma sırasında indüklenen hücre tipi temsilindeki değişiklikleri incelemek için bir mercek sağlar. Burada, murin ve insan timusundan yüksek kaliteli stromal hücre popülasyonlarının yanı sıra murin kemiği ve kemik iliğinden izolasyonu için adım adım protokoller sunuyoruz. Bu protokoller aracılığıyla izole edilen hücreler, yüksek kaliteli tek hücreli multiomik veri kümeleri oluşturmak için uygundur. Numune sindiriminin, hematopoietik soy tükenmesinin, FACS analizinin/sıralamasının etkileri ve bu faktörlerin tek hücreli dizileme ile uyumluluğu nasıl etkilediği burada tartışılmaktadır. Dizileme sonrası analizde başarılı ve verimsiz ayrışmayı ve aşağı akış stromal hücre verimlerini gösteren FACS profilleri örnekleri ile kullanıcılar için tanınabilir işaretçiler sağlanmaktadır. Stromal hücrelerin özel gereksinimlerini göz önünde bulundurmak, bu alandaki bilgiyi ilerletebilecek yüksek kaliteli ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için çok önemlidir.

In the healthy adult, de novo production of blood cells occurs in the bone marrow and the thymus. Stromal cells at these sites are essential for maintenance of hematopoiesis, but stroma constitutes less than 1% of the tissue1,2,3,4. Obtaining pure isolates of hematopoiesis supporting stroma therefore constitutes a significant challenge, particularly for single-cell multiomics that requires expedient processing to obtain samples of high quality. Components of different digestion cocktails may interfere with certain steps in multiomics analysis5,6. The protocols presented here detail the isolation of a wide variety of stromal cells from bone marrow and thymic tissues.
Perturbations of stromal constituents in both bone marrow and thymus result in profound disruption in blood cell development and can result in malignancies7,8,9. Hematopoiesis supporting stroma is damaged following cytotoxic conditioning and bone marrow transplantation, resulting in reduced secretion of cytokines and growth factors that sustain hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs)2,10,11. Furthermore, aging affects bone marrow and thymus stromal cells likely contributing to aged hematopoietic phenotypes. The thymus is the first organ to undergo extensive age-associated involution. Fat and fibrotic tissue start replacing T cell supportive stroma as early as the onset of puberty12,13. In the bone marrow, adipocyte content increases with age and the vascular and endosteal niches are significantly remodeled14,15,16.
To enable study of hematopoiesis supportive stroma across multiple stress states and in the case of the thymus of both human and murine tissue, we have optimized previously published digestion protocols1,2,8,17,18. These protocols ensure efficient and reproducible isolation of cells, and they are compatible with single-cell RNAsequencing (scRNAseq) and other types of multiomics.

Yazar Spotlight: Tek Hücre Dizilimi için Stromal Hücre İzolasyonu Kullanarak Hematopoietik Araştırmaları İlerletmek

Hematopoetik Organlardan Stromal Hücre İzolasyonu

Development of hematic cells in bone marrow and thymus is highly dependent on stromal cells for support. Perturbations of hematopoietic stromal cell function can lead to inefficient or even malignant blood production. Our lab is focused on understanding stromal cell regulation of hematopoiesis and how it can be manipulated for therapeutic benefits.The advent of single cell sequencing has driven a cascade of recent advances in many research fields. This is also the case in our field where single cell resolution has enabled the identification of heterogeneous stromal cell populations in hematopoietic organs that were previously unknown. Our protocols are optimized to address this, and we hope they will enable more research on stromal cells to tackle critical questions in the field.

Bu protokoller, akış sitometrik analizi için uygun timus ve kemik iliğinden tekrarlanabilir stromal hücre çeşitlerinin yanı sıra scRNA dizilemesi gibi tek hücreli multiomikler verir. Murin timik dokusu, kemik iliği naklinden önce gelen sitotoksik koşullanma veya doğal yaşlanma süreci gibi stres faktörlerine yanıt olarak önemli bir yeniden şekillenme geçirir. Sonuç olarak, timik hücresellik bu ayarların her ikisinde de büyük ölçüde azalır (Şekil 1A). 8 haftalık...

Watch this Scientific Journal Video about Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs at JoVE.com

Burada, tek hücreli multiomik ile uyumlu murin kemiği, kemik iliği, timus ve insan timik dokusundan stromal hücrelerin izolasyonunu sağlayan protokoller sunulmaktadır.

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens ...

Kemik iliği ve timusta hematik hücrelerin gelişimi, destek için büyük ölçüde stromal hücrelere bağlıdır. Hematopoietik stromal hücre fonksiyonunun bozulması, verimsiz ve hatta kötü huylu kan üretimine yol açabilir. Laboratuvarımız, hematopoezin stromal hücre regülasyonunu ve terapötik faydalar için nasıl manipüle edilebileceğini anlamaya odaklanmıştır.Tek hücre diziliminin ortaya çıkışı, birçok araştırma alanında son zamanlarda bir dizi ilerlemeye yol açmıştır. Bu aynı zamanda, tek hücre çözünürlüğünün, daha önce bilinmeyen hematopoetik organlarda heterojen stromal hücre popülasyonlarının tanımlanmasını sağladığı alanımızda da geçerlidir. Protokollerimiz bunu ele almak için optimize edilmiştir ve bu alandaki kritik soruları ele almak için stromal hücreler üzerinde daha fazla araştırma yapılmasını sağlayacaklarını umuyoruz.

stromal-cell-isolation-from-hematopoietic-organs

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

741 Görüntüleme.  Massachusetts General Hospital. Kemik iliği ve timusta hematik hücrelerin gelişimi, destek için büyük ölçüde stromal hücrelere bağlıdır. Hematopoietik stromal hücre fonksiyonunun bozulması, verimsiz ve hatta kötü huylu kan üretimine yol açabilir. Laboratuvarımız, hematopoezin stromal hücre regülasyonunu ve terapötik faydalar için nasıl manipüle edilebileceğini anlamaya odaklanmıştır.Tek hücre diziliminin ortaya çıkışı, birçok araştırma alanında son zamanlarda bir dizi ilerleme...

Video: Yazar Spotlight: Tek Hücre Dizilimi için Stromal Hücre İzolasyonu Kullanarak Hematopoietik Araştırmaları İlerletmek

Single-cell sequencing has enabled the mapping of heterogeneous cell populations in the stroma of hematopoietic organs. These methodologies provide a lens through which to study previously unresolved heterogeneity at steady state, as well as changes in cell type representation induced by extrinsic stresses or during aging. Here, we present step-wise protocols for the isolation of high-quality stromal cell populations from murine and human thymus, as well as murine bone and bone marrow. Cells isolated through these protocols are suitable for generating high-quality single-cell multiomics datasets. The impacts of sample digestion, hematopoietic lineage depletion, FACS analysis/sorting, and how these factors influence compatibility with single-cell sequencing are discussed here. With examples of FACS profiles indicating successful and inefficient dissociation and downstream stromal cell yields in post-sequencing analysis, recognizable pointers for users are provided. Considering the specific requirements of stromal cells is crucial for acquiring high-quality and reproducible results that can advance knowledge in the field.

Here we present protocols that enable isolation of stromal cells from murine bone, bone marrow, thymus and human thymic tissue compatible with single-cell multiomics.

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Stromal Cells from Murine Thymic Tissue for Generating High&#45;Quality Single Cell Multiomics Datasets

To begin, position the euthanized mouse on a surgical platform and open the chest cavity. Using surgical scissors, make a transverse incision below the rib cage and cut ribs on each side of the mouse to the clavicle. Then cut the diaphragm to release the chest wall And lift ribs with forceps to expose the thoracic cavity.Hold the thymus with forceps, and gently cut the connective tissue holding the thymus in place. To perform enzymatic dissociation of murine thymic tissue, place the cleaned thymus in a 15 milliliter tube cap and use sterile surgical scissors to finely mince the tissue. Add two milliliters of murine dissociation cocktail to the tube.Attach the cap containing the thymus pieces and invert the tube five times to re-suspend the tissue. Wrap the tube cap in paraffin film. After incubation, place the tube in a rack and allow the tissue to settle.Remove the supernatant and pass it over a 70 micrometer cell strainer into a 50 milliliter ice cold tube. Then, add 20 milliliters of M1 99 with 2%FBS medium to the cell suspension. Centrifuge the tube at 500 G for five minutes at four degrees Celsius.After discarding the supernatant, re-suspend the pellet in M1 99 and 2%FBS medium.

Yüksek Kaliteli Tek Hücreli Multiomik Veri Kümeleri Oluşturmak için Murin Timik Dokusundan Stromal Hücrelerin İzolasyonu

Stromal Cell Extraction from Mouse Bone and Bone Marrow for Superior Single Cell Multi&#45;Omics Data

To begin, take the femur, tibia, pelvis, and humerus bones isolated from a mouse. Use a scalpel to cut through the growth plates of long bones, removing the epiphysis. Place it in a 10-centimeter dish with M199 medium plus 2%FBS on ice.Next, use a 28-gauge needle and a 10-milliliter syringe filled with M199 medium plus 2%FBS to flush the marrow into a 15-milliliter tube on ice. Place the flushed bone in the dish with the epiphysis. Leave the 15-milliliter tube upright on ice until the marrow settles.Then remove the M199 medium plus 2%FBS Add four milliliters of the B&M dissociation cocktail to the 15-milliliter tube and incubate in a 37 degree Celsius water bath. After incubation, collect the supernatant and filter through a 70-micrometer cell strainer into a cold 50-milliliter tube. Add two milliliters of fresh B&M dissociation cocktail to the remaining bone marrow pellet and return it to the water bath.Using a one-milliliter pipette, vigorously pipette any remaining bone marrow pieces. Collect all cell suspension in the same tube as before. Add 20 milliliters of M199 medium with 0.5%BSA, and two-millimolar EDTA to the cell suspension.Afterward, centrifuge the cells at 500 G for five minutes at four degrees Celsius. Resuspend the pellet in 500 microliters of PBS with a 0.5%BSA and biotin antibodies. Incubate on an orbital shaker for 10 minutes at room temperature in the dark.Next, vortex the magnetic beads thoroughly. Add 25 microliters of the beads to the tube and incubate again on the orbital shaker. Place the tube in a matching magnet for two to three minutes and collect the supernatant in a fresh tube.Break the bones into smaller pieces in the 10-centimeter dish using the flat cap end of a 50-milliliter tube. Filter the supernatant through a 70-micrometer cell strainer to isolate bone fragments. Cut the bone fragments in the cell strainer with scissors.Place the filter with the bone fragments on a 50-milliliter tube and open the filter with the scalpel. With tweezers, transfer the bone fraction to five milliliters of murine B&M dissociation mix. Then place the tube horizontally in a 37 degree Celsius water bath with 120 RPM shaking for 30 minutes.After digestion, add 25 milliliters of M199 medium with 0.5%BSA and two-millimolar EDTA. Filter the supernatant containing stromal cells through a 70-micron cell strainer into a cold 50-milliliter tube.