Mikroglia izolasyonu ile ilgili teknik yardım için Regina Piske'ye ve Ek Şekil S1'de mikroskopi görüntü elde etme konusundaki yardımı için Dr. Caio Andreta Figueiredo'ya teşekkür ederiz. MDC'nin FACS tesisine teknik destekleri için teşekkür ederiz. Bu makale, 2024 yılında Beyin, Davranış ve Bağışıklık Dergisi'ne sunulan temsili rakamları kısmen sunmaktadır. Şekil 1A, Şekil 2A ve Ek Şekil S3A, BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur.

Deneysel prosedürün genel bir görünümü Şekil 1A'da grafiksel olarak gösterilmiştir. Kullanılan canlı hayvanların işlenmesiyle ilgili tüm deneyler, Alman Hayvanları Koruma Kanunu'na sıkı sıkıya bağlı olarak gerçekleştirilmiş ve Berlin'deki Sağlık ve Sosyal Hizmetler Bölge Ofisi (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Almanya) tarafından onaylanmıştır. Fareler, Max Delbrück Moleküler Tıp Merkezi'nin (MDC) hayvan çekirdek tesisinde 12:12 saat aydınlık/karanlık döngüsü ile standart laboratuvar koşulları altında havalandırmalı kafeslerde grup halinde barındırıldı. Yiyecek ve su ad libitum olarak sağlandı.Tamponların ve reaktiflerin bileşimi için Tablo 1'e ve bu protokolde kullanılan tüm reaktifler, aletler ve malzemelerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın. vGLUT1'e özgü test için, akış sitometrisinin doku homojenizasyonu ve hücre izolasyonu gerektirdiğini ve mikroglia'nın izolasyon prosedüründen sonra yaklaşık% 95 canlılık gösterdiğini kabul etmek için el yazması boyunca in vivo* terimini kullandık (Şekil 1B ve Ek Şekil S1). Bu nedenle, fiksasyona kadar kısa bir süre için sinaptik materyali ex vivo olarak yutma yeteneklerini korurlar. Bu nedenle, vGLUT1 + mikroglia'nın miktar tayini, fiksasyon adımına kadar hem in vivo hem de kısa süreli ex vivo yutmayı içerir.
1. Glutamaterjik sinapsların mikroglia tarafından in vivo * yutulmasının tespiti için hücre içi vGLUT1 boyama
NOT: Aşağıdaki hücre izolasyon prosedürü16'dan uyarlanmıştır. Hücre izolasyonunun tüm adımları buz üzerinde gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Pentobarbitalin intraperitoneal enjeksiyonunu kullanarak fareleri uyuşturun. Fareleri 10 mL buz gibi Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile ~ 2 dakika boyunca intrakardiyal olarak perfüze edin. NOT: Örnek (n) başına bir fare kullanılır.</li>
	<li>Beyni kafatasından çıkarın ve 1 mL nöral hücre ortamında koruyun. NOT: Hibernate-A ortamı gibi nöral hücre ortamı, doku ayrışma sürecini takiben hücrelerin yüksek canlılığını sağlamak için kullanılır.</li>
	<li>Beyni, 1 mL buz gibi soğuk nöral hücre ortamı ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın ve hipokampusu daha önce tarif edildiği gibiinceleyin 17.</li>
	<li>Hipokampusu 1 mL nöral hücre ortamı ile doldurulmuş bir Dounce homojenizatöre aktarın ve yaklaşık ~ 25 hafif vuruşla gevşek havaneli kullanarak dokuyu ayırın.</li>
	<li>5 mL'lik bir polipropilen tüpe 70 μm'lik bir süzgeç yerleştirin ve 500 μL nöral hücre ortamı ekleyin. Doku homojenatını süzgeçten geçirerek 5 mL'lik polipropilen tüpe aktarın.</li>
	<li>Dounce homojenizatörü 2x'i 1 mL soğuk nöral hücre ortamı ile durulayın ve numuneleri 400 × g'da 8 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı aspire edin ve peleti nazik pipetleme yoluyla 500 μL buz gibi DPBS'de yeniden süspanse edin. Homojen bir süspansiyon sağlayın ve DPBS kullanarak son hacmi 1,5 mL'ye tamamlayın.</li>
	<li>Numuneye 500 μL izotonik Percoll çözeltisi ekleyin, hafifçe yeniden süspanse edin ve 2 ml daha soğuk DPBS ile kaplayın.</li>
	<li>Numuneleri 3.000 × g'da 10 dakika boyunca tam hızlanma ve fren olmadan santrifüjleyin. Orta fazda üst tabakayı ve miyelin diskini aspire edin. NOT: Aşağıdaki tüm santrifüjleme adımları, aksi belirtilmedikçe 4 ° C'degerçekleştirilir.</li>
	<li>4 mL soğuk DPBS ekleyin ve numuneleri 400 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 100 μL sabitlenebilir canlılık boyama çözeltisinde yeniden süspanse edin ve numuneleri 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Numuneye 1 mL soğuk DPBS ekleyin ve numuneleri 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve 100 μL CD16 / CD32 boyama çözeltisi (FACS tamponunda 1/200) ekleyin. ~5 saniye vorteksleyin ve 4 °C'de 10 dakika inkübe edin. NOT: CD16 / CD32 boyama, akış sitometrisi gibi uygulamalardan önce antikorların mikroglia gibi FcR taşıyan hücrelere spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirmek için bir ön işlemdir.</li>
	<li>Numuneye 1 mL FACS tamponu ekleyin ve 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve 100 μL boyama ana karışımı-I ekleyin (1x FACS Tamponunda 1/100 anti-CD11b / anti-CD45 + 1/200 anti-Ly6C / anti-Ly6G). Numuneleri karanlıkta 4°C'de 20 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Numuneye 1 mL FACS tamponu ekleyin ve 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Peleti 250 μL fiksasyon tamponunda yeniden süspanse edin. 4 °C'de 25 dakika inkübe edin.</li>
	<li>2 mL 1x geçirgenleştirme (PERM) Tamponu ekleyin ve 300 × g 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı atın ve 100 μL vGLUT1 veya izotip kontrol boyama solüsyonu ekleyin. ~5 saniye vorteksleyin ve numuneleri 4 °C'de 50 dakika inkübe edin.</li>
	<li>2 mL 1x PERM Tamponu ekleyin ve 300 × g 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve numunelere 2 mL FACS tamponu ekleyin.</li>
	<li>300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücreleri 250 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve numuneleri 40 μm'lik bir süzgeç filtresinden geçirin.</li>
	<li>Akış sitometrisi kullanarak tek/canlı/CD1b++/CD45+ mikrogliadan vGLUT1 floresan yoğunluğunu analiz edin. Dalak makrofajlarını her deney için negatif kontrol olarak kullanın.<ol><li>Kıyılmış dalak dokusunu 70 μm'lik bir süzgeç filtresinden iki kez hafifçe sıkıştırarak splenositleri izole edin. Filtreleri 40 mL DPBS ile durulayın ve süspansiyonu 50 mL'lik konik bir tüpte toplayın.</li>
		<li>350 × g'yi 10 dakika santrifüjleyin ve elde edilen peleti 1 mL'lik bir kırmızı kan hücresi lizis tamponu çözeltisinde yeniden süspanse edin. Buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.</li>
		<li>İnkübasyondan sonra numuneye 10 mL DPBS ekleyin ve 350 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>1.11 ve 1.17 adımları arasında açıklanan boyama adımlarına devam edin. NOT: Geçit stratejisi, dalak makrofajlarını CD11b ++/ CD45 ++/ Canlı hücre popülasyonu olarak tanımlamak için Ek Şekil S2'de verilmiştir.</li>
		<li>Geçit stratejisi (Şekil 1)<ol><li>Birincil kapı: İleri Saçılma Alanını (FSC-A) [x ekseni] ve Yan Saçılma Alanını (SSC-A) [y ekseni] kapılı alana mikroglia popülasyonunu dahil edecek ve hücresel kalıntıları hariç tutacak şekilde ayarlayın.</li>
			<li>Çiftleri hariç tutmak için İleri Saçılma Alanını (FSC-A) [x ekseni] ve İleri Saçılma Yüksekliğini (FSC-H) [y ekseni] ayarlayın. Tekliler bu nokta grafiğinde köşegen olarak görünür.</li>
			<li>CD11b-PECy7 [y ekseni] ve CD45-APC'yi [x ekseni] ayarlayın ve popülasyonu yüksek yüzey seviyesi CD11b ve orta seviye CD45 ile mikroglia olarak kapılayın.</li>
			<li>FITC [y ekseni] negatif kapısındaki ölü hücreleri hariç tutun. İSTEĞE BAĞLI: CNS ile ilişkili makrofajları analizden çıkarmak için FITC negatif kapısında Ly6C- ve Ly6G-FITC için pozitif olan hücreleri de hariç tutun. NOT: Canlı hücrelerin aksine, zarları bozulmuş ölü hücreler, sabitlenebilir canlılık boyasının sitoplazmaya girmesine izin verir, bu da protein etiketlememiktarını artırır 18. Böylece ölü hücreler, tanımlanan kapıya dahil olan canlı hücrelerden daha parlak olacaktır.</li>
			<li>CD45-APC [x ekseni] ve vGLUT1-PE [y ekseni]'ni ayarlayın; dalak örneğinde herhangi bir pozitif olay tespit edilmediği eşik kapısının üzerindeki popülasyon (dahili biyolojik negatif kontrol, Şekil 1E), örnekteki vGLUT1-pozitif fraksiyon olarak kabul edilir.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Ham sinaptozomların mikroglia tarafından in vitro yutulmasının tespiti
<ol><li>Ham sinaptozom hazırlama ve pHrodo Kırmızı etiketleme NOT: Aşağıdaki tüm adımlar buz üzerinde gerçekleştirilmelidir.<ol><li>1.1 ila 1.2 arasındaki adımları izleyin.</li>
		<li>Beyni 1 mL buz gibi soğuk nöral hücre ortamı ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın ve hipokampusu dikkatlice inceleyin. Petri kabını her zaman buz üzerinde tutun. Bir sonraki adımda mikroglia izolasyonu için hipokampi kullanın.</li>
		<li>Beynin geri kalanını (beyincik ve koku soğanı hariç) 1 mL sinaptik protein ekstraksiyon reaktifi ile doldurulmuş bir Dounce homojenizatöre aktarın ve gevşek havaneli kullanarak dokuyu yaklaşık ~ 30 vuruşla nazikçe ayırın. Ekstraksiyon reaktifinin 10 mL'si başına bir tablet proteaz inhibitörünü destekleyin ve sinaptozomları üreticinin talimatlarına göre izole edin. NOT: SynPER19 gibi sinaptik protein ekstraksiyon reaktifleri, biyolojik olarak aktif sinaptik öncesi ve sonrası proteinler içeren sinaptozomları hazırlamak için kullanılır.</li>
		<li>Ham sinaptozom peletini 500 μL 0.1 MNa2CO3çözeltisi içinde çözün. Sinaptozom örneğini 10 μL 0.2 mM pHrodo Kırmızısı ile boyayın. Ham sinaptozom örneklerini oda sıcaklığında (24-25 ° C) 1,5 saat hafif çalkalama ile inkübe edin.</li>
		<li>Numuneye 1 mL soğuk DPBS ekleyin, tam hızda (20.815 × g) 1 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin.</li>
		<li>Örneklerden bağlanmamış aşırı pHrodo Red'i çıkarmak için adım 2.1.5'i toplamda 7x tekrarlayın.</li>
		<li>Son santrifüjden sonra, numunenin protein konsantrasyonlarını ölçmek için standart bir BCA testi yapın.</li>
		<li>İsteğe bağlı: Sıvı nitrojen kullanarak DPBS'de sinaptozom örneklerini %5 DMSO ile dondurun ve -80 °C'de 3 hafta boyunca saklayın. Işığa maruz kalmayı minimumda tutmak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün.</li>
	</ol></li>
	<li>In vitro Yeni İzole Edilmiş Yetişkin Mikroglia Kullanılarak Ham Sinaptozom Yutulma Testi<ol><li>aCSF'yi hazırlayın ve 30 dakika boyunca% 95O:% 5CO2 ile dengeleyin. NOT: 2.2.2-2.2.4 adımları için, papain bazlı sindirim solüsyonunun hazırlanması için üreticinin talimatlarını izleyin.</li>
		<li>Papain kitindeki flakon 2'ye 4 mL aCSF ekleyin. Şişeyi, papain çözeltisi berrak görünene kadar ~ 10 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.</li>
		<li>Papain kitindeki flakon 3'e 400 μL aCSF ekleyin. Yavaş pipetleme ile ~10 kez nazikçe karıştırın.</li>
		<li>Flakon 3'ten flakon 2'ye 200 μL ekleyin (adım 2.2.3'te yeniden yapılandırılmıştır). Şişenin geri kalanını saklayın 3.</li>
		<li>Adım 2.1.2'de diseke edilen hipokampusu alın ve disseke edilmiş hipokampusu bir neşter kullanarak kıyın.</li>
		<li>Kıyılmış hipokampusu, adım 2.2.5'te hazırlanan 2 mL enzim çözeltisi ile doldurulmuş bir doku ayrıştırıcı tüpe aktarın. Tüpü doku ayrıştırıcıya yerleştirin ve programı çalıştırın: 37C_ABDK_01 (~ 30 dakika sürer).</li>
		<li>Numuneleri ~20 dakika boyunca 37 °C'de bir su banyosuna koyun ve karışımı her 5 dakikada bir 1 mL'lik bir pipet kullanarak kabarcık oluşturmadan ezin. NOT: Etkili bir ayrışma sağlamak için doku tamamen ayrışana ve tamamen homojen görünene kadar bu işleme devam edilmelidir. Aşağıdaki tüm santrifüjleme adımları, aksi belirtilmedikçe 4 ° C'degerçekleştirilir.</li>
		<li>Bulanık hücre süspansiyonunu dikkatlice 15 mL'lik yeni bir tüpe çıkarın ve 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Bu 5 dakikalık süre boyunca, numune başına aşağıdaki yıkama karışımını (5 mL) hazırlayın; papain kitinde sağlanan 500 μL sulandırılmış albümin-ovomokoid inhibitör solüsyonunu 4.5 mL aCSF'ye ekleyin. Kalan çözeltiyi 2.2.5 adımındaki şişe 3'te yıkama karışımına ekleyin.</li>
		<li>Süpernatanı adım 2.2.8'den atın ve hücre peletini yıkama karışımı solüsyonunda hemen yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Numuneyi 70 μm'lik bir filtreden 5 mL'lik yeni bir mikrosantrifüj tüpüne geçirin. Numuneleri 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Daha önce adım 1.7-1.9'da açıklanan Percoll gradyan santrifüjleme adımıyla devam edin.</li>
		<li>Hücreleri MACS boyama tamponunda yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek dikkatlice yeniden süspanse edin. Numuneleri 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Her numuneye 1 mL MACS tamponu ekleyin ve 300 × g'da 8 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Hücreleri 500 μL MACS tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Pozitif seçim sütunlarını manyetik ayırıcıya yerleştirin. Sütunları 3 mL MACS Tamponu ile durulayarak dengeleyin.</li>
		<li>Yavaşça karıştırın ve 500 μL hücre süspansiyonunu kolona uygulayın. Kolonları 3 mL MACS Tamponu ile 3x yıkayın.</li>
		<li>Sütunları manyetik ayırıcıdan çıkarın ve 15 mL konik tüplerin üzerine yerleştirin. Kolona 5 mL MACS tamponu ekleyin ve hücreleri hemen bir dolgunlaştırıcı kullanarak yıkayın. Numuneleri 300 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Bu süre zarfında, DPBS'de 20 mL% 40 FBS hazırlayın. Numune başına 1 mL DMEM'i bir su banyosunda 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.</li>
		<li>Son hücre peletini 1 mL önceden ısıtılmış DMEM'de çözün. 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 500 μL önceden ısıtılmış DMEM'de yaklaşık ~ 150.000-200.000 hücre tohumlayın. Kontrol olarak, 1-2 ekstra kuyucuğa benzer sayıda hücre tohumlayın. Bir ışık mikroskobu kullanarak tüm kuyucuklardaki hücrelerin birleşimini kontrol edin. NOT: Hedef beyin bölgesi hipokampus veya nispeten küçük beyin bölgeleri ise, ~ 150.000 mikroglia'yı izole etmek için örnek (n) başına 5 fare toplanabilir. Tüm beyin için, her iki izolasyon protokolünü kullanarak benzer sayıda hücre elde etmek için n'de 1 fare yeterli olacaktır. Alternatif olarak, yutma testini başlatmak için ~ 40.000 hücre, 100 μL nihai hacimde 96 oyuklu plakalarda kaplanabilir. Bu, analiz edilen hücre sayısını azaltır, ancak aynı zamanda n başına kullanılan fare sayısını da azaltır. DMEM'de FCS eksikliğine bağlı protein yoksunluğu fagositozu tetikleyecektir.</li>
		<li>Plakayı inkübatörde 1-2 saat inkübe edin (37 °C ve% 5 CO2). NOT: Bu adım, hücrelerin, fonksiyonel yutma testinin başlamasından önce izolasyon prosedürünün strese eğilimli etkilerinden kurtulmasını amaçlar.</li>
		<li>Her oyuktan çok yavaş bir şekilde 250 μL ortam alın, her oyuğa 250 μL taze önceden ısıtılmış DMEM ekleyin ve üstüne 3 μg pHRodo Kırmızı etiketli sinaptozom ekleyin. Bir ışık mikroskobu kullanarak tüm kuyucuklardaki hücre birleşmesini kontrol edin.<ol><li>Negatif kontrol kuyuları için, hücrelerle tohumlanmış ekstra kuyuya aynı miktarda etiketlenmemiş sinaptozom ekleyin.</li>
			<li>Test kuyuları için, kuyu 1'in yalnızca hücreler içerdiğinden emin olun; kuyu 2 hücreler + etiketlenmemiş sinaptozomlar içerir; kuyu-3 hücreler + 3 μg pHrodo Kırmızısı içerir; kuyu 4 DMEM + 3 μg pHrodo Red içerir.</li>
		</ol></li>
		<li>Hücreleri inkübatörde 2 saat boyunca sinaptozomlarla inkübe edin (37 ° C ve% 5 CO2).</li>
		<li>Ortamı çıkarın ve kuyuları soğuk DPBS ile yıkayın. Hücreleri 35 saniye ayırmak için oyuk başına 200 μL Tripsin / EDTA çözeltisi ekleyin.</li>
		<li>Oyuk başına DPBS'ye 1 mL %40 FBS ekleyin ve hücreleri süzgeçten 5 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın. Hücrelerin ayrılmasını kolaylaştırmak için bu işlem sırasında hem plakayı hem de tüpü buz üzerinde tutun.</li>
		<li>500 μL buz gibi soğuk DPBS kullanarak her kuyuyu 2 kez yıkayın. Toplanan numuneleri 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>100 μL FACS tamponunda 1/200 CD16 / CD32 içeren boyama solüsyonundaki hücreleri yeniden süspanse edin ve buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.</li>
		<li>İnkübasyondan sonra, her birinden 1/100 nihai konsantrasyon ile boyama çözeltisine CD11b ve CD45 ekleyin. Numuneleri karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Numuneleri 1 mL FACS tamponu ile yıkayın ve 300 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Peleti 250 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve akış sitometrisi kullanarak en az 100.000 toplam olay kaydedin. CD11b ++ / CD45 + mikroglia'dan pHrodo Red floresan yoğunluğunu analiz edin.</li>
		<li>Geçit stratejisi (Şekil 2C)<ol><li>Birincil geçidi ayarlayın: İleri Saçılma Alanı (FSC-A) [x ekseni] ve Yan Saçılma Alanı (SSC-A) [x ekseni], kapılı alana mikroglia popülasyonunu dahil etmek ve hücresel kalıntıları hariç tutmak için.</li>
			<li>Çiftleri hariç tutmak için İleri Saçılma Alanını (FSC-A) [x ekseni] ve İleri Saçılma Yüksekliğini (FSC-H) [y ekseni] ayarlayın. Tekliler bu nokta grafiğinde köşegen olarak görünür.</li>
			<li>CD11b-PECy7 [y ekseni] ve CD45-APC'yi [x ekseni] ayarlayın ve popülasyonu yüksek yüzey seviyesi CD11b ve orta seviye CD45 ile mikroglia olarak kapılayın.</li>
			<li>Bu popülasyondan pHrodo-PE'nin medyan floresan yoğunluğunu hesaplayın. Negatif kontrol olarak etiketlenmemiş sinaptozomlarla inkübe edilmiş aynı hücreleri kullanın.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

Sinaptik Materyallerin Mikroglial Yutulması için Akış Sitometrisi Tabanlı Testler

<ol>
	<li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+physiology+and+Disease.">Microglia in physiology and Disease.</a> Annu Rev Physiol. 79, 619-643 (2017).</li><li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain.">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li><li>Tremblay, M. &. #. 2. 0. 0. ;., Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience.">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biol. 8 (11), e1000527 (2010).</li><li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development.">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+contribute+to+circuit+defects+in+Mecp2+null+mice+independent+of+microglia-specific+loss+of+Mecp2+expression.">Microglia contribute to circuit defects in Mecp2 null mice independent of microglia-specific loss of Mecp2 expression.</a> eLife. 5, e15224 (2016).</li><li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner.">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li><li>Filipello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microglial+innate+immune+receptor+TREM2+is+required+for+synapse+elimination+and+normal+brain+connectivity.">The microglial innate immune receptor TREM2 is required for synapse elimination and normal brain connectivity.</a> Immunity. 48 (5), 979-991 (2018).</li><li>Salter, M. W., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+emerge+as+central+players+in+brain+disease.">Microglia emerge as central players in brain disease.</a> Nat Med. 23 (9), 1018-1027 (2017).</li><li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models.">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), 712-716 (2016).</li><li>Di Liberto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+under+T+cell+attack+coordinate+phagocyte-mediated+synaptic+stripping.">Neurons under T cell attack coordinate phagocyte-mediated synaptic stripping.</a> Cell. 175 (2), 458-471 (2018).</li><li>Bisht, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dark+microglia:+A+new+phenotype+predominantly+associated+with+pathological+states.">Dark microglia: A new phenotype predominantly associated with pathological states.</a> Glia. 64 (5), 826-839 (2016).</li><li>Weerasinghe-Mudiyanselage, P. D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+plasticity+of+the+hippocampus+in+neurodegenerative+diseases.">Structural plasticity of the hippocampus in neurodegenerative diseases.</a> Int J Mol Sci. 23 (6), 3349 (2022).</li><li>Aw, E., Zhang, Y., Carroll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+responses+to+peripheral+type+1+interferon.">Microglial responses to peripheral type 1 interferon.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 340 (2020).</li><li>Brioschi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+synaptic+proteins+in+microglia+by+flow+cytometry.">Detection of synaptic proteins in microglia by flow cytometry.</a> Front Mol Neurosci. 13, 149 (2020).</li><li>Norris, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+integrity+and+complement+control+synaptic+material+clearance+by+microglia+after+CNS+injury.">Neuronal integrity and complement control synaptic material clearance by microglia after CNS injury.</a> JEM. 215 (7), 1789-1801 (2018).</li><li>Mattei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dissociation+induces+transcriptional+and+proteotype+bias+in+brain+cell+populations.">Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 7944 (2020).</li><li>Jaszczyk, A., Stankiewicz, A. M., Juszczak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+mouse+hippocampus+with+its+dorsal,+intermediate+and+ventral+subdivisions+combined+with+molecular+validation.">Dissection of mouse hippocampus with its dorsal, intermediate and ventral subdivisions combined with molecular validation.</a> Brain Sci. 12 (6), 799 (2022).</li><li>Fixable viability dyes for flow cytometry. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents/cell-viability-assays-flow-cytometry/fixable-viability-dyes-flow-cytometry.html">https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents/cell-viability-assays-flow-cytometry/fixable-viability-dyes-flow-cytometry.html</a> (2024)</li><li>SynPER synaptic protein extraction reagent. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/87793?gclid=CjwKCAiAi6uvBhADE_iwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC3VJNgrPEm1I64E2P">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/87793?gclid=CjwKCAiAi6uvBhADE_iwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC3VJNgrPEm1I64E2P</a> (2024)</li><li>Wu, A., Yu, B., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+in+olfactory+bulb+circuits.">Plasticity in olfactory bulb circuits.</a> Curr Opin Neurol. 64, 17-23 (2020).</li><li>pHrodo indicators for pH determination. Thermo Fisher Scientific Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/de/de/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/phrodo-indicators.html">https://www.thermofisher.com/de/de/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/phrodo-indicators.html</a> (2024)</li><li>Rangaraju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+phagocytic+properties+of+CD45low+microglia+and+CD45high+brain+mononuclear+phagocytes-activation+and+age-related+effects.">Differential phagocytic properties of CD45low microglia and CD45high brain mononuclear phagocytes-activation and age-related effects.</a> Front Immunol. 9, 405 (2018).</li><li>Weinhard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+remodel+synapses+by+presynaptic+trogocytosis+and+spine+head+filopodia+induction.">Microglia remodel synapses by presynaptic trogocytosis and spine head filopodia induction.</a> Nat Commun. 9 (1), 1228 (2018).</li><li>Morizawa, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+pruning+through+glial+synapse+engulfment+upon+motor+learning.">Synaptic pruning through glial synapse engulfment upon motor learning.</a> Nat Neurosci. 25 (11), 1458-1469 (2022).</li><li>Morini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+tools+for+studying+microglial-mediated+synapse+elimination+and+refinement.">Strategies and tools for studying microglial-mediated synapse elimination and refinement.</a> Front. Immunol. 12, 640937 (2021).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry. Part A: J. Int Soc Anal Cytol. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>. Strategies for intracellular flow cytometry success Available from: <a target="_blank" href="https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/582159-Strategies-for-Intracellular-Flow-Cytometry-Success/">https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/582159-Strategies-for-Intracellular-Flow-Cytometry-Success/</a> (2022)</li><li>. Isotype control antibodies, Key points Available from: <a target="_blank" href="https://www.antibodies.com/primary-antibodies/isotype-control-antibodies#:~:text=Isotype%20controls%20should%20be%20used">https://www.antibodies.com/primary-antibodies/isotype-control-antibodies#:~:text=Isotype%20controls%20should%20be%20used</a> (2024)</li><li>Flow cytometry intracellular staining controls. Bio-Rad Available from: <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-intracellular-controls.html">https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-intracellular-controls.html</a> (2024)</li><li>Dissing-Olesen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FEAST:+A+flow+cytometry-based+toolkit+for+interrogating+microglial+engulfment+of+synaptic+and+myelin+proteins.">FEAST: A flow cytometry-based toolkit for interrogating microglial engulfment of synaptic and myelin proteins.</a> Nat Commun. 14, 6015 (2023).</li><li>Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+general+and+discriminating+markers+of+differential+microglia+phenotypes.">Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes.</a> Front Cell Neurosci. 14, 198 (2020).</li><li>van Wageningen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+microglial+TMEM119+and+P2RY12+immunoreactivity+in+multiple+sclerosis+white+and+grey+matter+lesions+is+dependent+on+their+inflammatory+environment.">Regulation of microglial TMEM119 and P2RY12 immunoreactivity in multiple sclerosis white and grey matter lesions is dependent on their inflammatory environment.</a> Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 206 (2019).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Mikroglia-sinaps etkileşimi yoluyla sinaptik arıtma, nöroimmünoloji alanında ilgi çekici bir çalışma alanıdır ve mikroglianın nörodejeneratif ve nörogelişimsel bozukluklardaki rolü hakkında umut verici bilgiler sunar. 2011 yılında; Paolicelli ve ark. mikroglia içinde sinaptik materyalin varlığına dair kanıtlar sağladı ve sinaptik yutulma sürecine katılımlarına ışık tuttu4. Bir başka ilgi çekici çalışma, hızlandırılmış görüntüleme ve ex vivo organotipik beyin dilimi kültürü modeli kullandı ve mikrogliaların trogositoz olarak bilinen fagositik bir sürece girdiğini ve burada tüm sinaptik yapıdan ziyade presinaptik yapıları yuttuklarını bildirdi23. Sağlam dokuda fagositozun ölçülmesini sağlayan yeni bir transgenik fare modelini kullanan çok yeni bir yayın, motor öğrenme üzerine in vivo olarak Bergmann-glia tarafından budamayı gösterdi24. Bu nedenle, mikroglia da dahil olmak üzere sinaptik yutulmada glial hücrelerin yer aldığını gösteren yeterli kanıt vardır. Bununla birlikte, bu mikroglial fonksiyonun dinamik ve seçici sinaptik budama sürecini ne ölçüde etkilediği daha fazla kanıt gerektirir.
Bununla birlikte, sinapsların mikroglial yutulmasının nicelleştirilmesi, değerli bir gösterge olarak hizmet eder ve mikroglia-sinaps etkileşimlerinin karmaşık dinamikleri, özellikle sinaptik arıtma hakkında kısmi bilgi sağlar. Kapsamlı bir derleme, sinapsların25 mikroglia yutulmasını araştırmak için kullanılan mevcut protokolleri özetlemiştir. Protokollerimizin halihazırda kullanımda olan mevcut protokollere göre optimize edildiğini vurgulamak isteriz. Bu çalışmada sunulan yöntemler, çeşitli diseke beyin bölgelerindeki sinapsların hızlı ve yüksek verimli miktar tayini, mikroglial yutulmasını sağlar. Beyin bölgesine bağlı olarak, her iki metodoloji için de en fazla iki gün içinde en az 10.000 mikroglial hücrenin analizi mümkündür ve bu da onları birden fazla fare modelini paralel olarak test etmek için değerli kılar.
vGLUT1 + microglia'nın miktar tayininin, fiksasyon adımına kadar hem in vivo hem de kısa süreli ex vivo yutmayı içerdiğini kabul ediyoruz. Bu nedenle, tahlilimizin, IHC gibi yaklaşımları kullanarak in vivo doğrulamadan önce bir ilk adım olarak mikroglia içindeki sinaptik materyali ölçmek için hızlı ve güvenilir bir yol sunduğunu öneriyoruz.
Akış sitometrisi analizinin bir başka dezavantajı, özellikle inhibitör sinapslar için sinaptik belirteçler için antikorların sınırlı mevcudiyetidir. Bu belirteçler için parlak bir sinyal gösteren, ticari olarak temin edilebilen, doğrudan konjuge antikorlar bulmak zordur. Sinaptik belirteçleri hedef alan farklı antikorları test etmek için gereken kapsamlı optimizasyon süresi göz önüne alındığında, bu çalışmada yaptığımız gibi, farklı antikorlarla hücre içi boyama için iyi optimize edilmiş prosedürleri bilimsel toplulukla paylaşmak önemlidir.
Bu çalışmadaki veri analizi ile ilgili olarak, akış sitometrisi tabanlı tahlilleri optimize ederken bir numunedeki bir antikorun spesifik olmayan bağlanması için bir tahmin sağladıklarından, vGLUT1 antikorunun spesifik olmayan bağlanmalarını hesaba katmak için teknik negatif kontroller olarak İzotip kontrollerini kullandık26. Bununla birlikte, izotip kontrolleri, yüzey boyama prosedürlerinden gelen spesifik olmayan arka plan sinyalini tespit etmek için çoğunlukla optimize edilmiştir ve hücre içi boyama kontrolleri için optimal değildir27,28. Bu nedenle, antijen tespitini, otofloresan ve florofor parlaklığını etkileyebilecek fiksasyon ve geçirgenlik aşamalarını içeren hücre içi boyama yapılırken negatif ve pozitif popülasyonları ayırt etmek için onlara güvenilmemelidir29. Bu tür hücre içi boyama prosedürleri, bir hücre içi belirteç29 için boyanan pozitif hücre popülasyonunu tanımlamak için uygun biyolojik iç kontrollerin kullanılmasını gerektirir. Bu nedenle, hücre içi bir boyama protokolü kullandığımızı göz önünde bulundurarak, dahili bir biyolojik negatif kontrol (dalak makrofajları) kullandık ve aynı farelerden izole edilen dalak makrofajlarına göre pozitif ve negatif popülasyonlar arasındaki sınırı tanımladık. VGLUT1 pozitif olayın olmadığı kapının üzerindeki pozitif popülasyonu, biyolojik negatif kontrol görevi gören dalak makrofajlarından ayırdık (Şekil 1).
Bu çalışmada sunulan her iki yöntem de, küçük beyin bölgelerinden 10.000'den fazla hücreyi analiz ederek, sinapsların mikroglial yutulmasının hızlı ve yüksek verimli bir şekilde ilk analizi için büyük bir potansiyel sunmaktadır ve bu, standart mikroskopi teknikleriyle elde edilemez. Bu nedenle, bu yöntemler emek ve zaman yoğun yöntemlere göre önemli bir avantaj sunar ve ayrıca, daha fazla sayıda mikroglia analizine izin vererek sinaptik yutulmanın daha kapsamlı bir analizini sağlar. Ek olarak, bu çalışmada sunulan in vitro yöntem, farklı tedavilerin sinapsların mikroglial yutulması üzerindeki etkisini test etmek için özellikle yararlıdır. Diğer hücre tipleriyle ilişkili kafa karıştırıcı faktörler olmadan tedavinin mikroglia üzerindeki etkisinin doğrudan ölçülmesini sağlar. Ek olarak, mikro çevrenin veya diğer hücre tiplerinin sinaptik yutma süreci üzerindeki potansiyel etkisini kanıtlamak için dolaylı bir yaklaşım olarak hizmet eder. Bu nedenle, bu yöntemlerin, özellikle paralel olarak kullanıldığında, sinaptik materyallerin mikroglial yutulmasının analizi için sezgisel ve avantajlı alternatifler sunduğu sonucuna varıyoruz.
Bununla birlikte, taze izole edilmiş mikroglia'nın FACS bazlı fagositik tahlillerle ex vivo analizi birkaç dezavantaj oluşturabilir. İlk olarak, mikroglia'nın ex vivo aktivasyonundan ve stres tepkisinden kaçınırken, yetişkin beyninden yeni izole edilmiş mikroglia üreten iyi optimize edilmiş protokoller kullanmak çok önemlidir. Dissing-Olesen ve ark. bu sorunun üstesinden gelmek için 37 oC30'da bir doku ayrışma prosedürü uygulayarak transkripsiyonel ve translasyonel inhibitörlerin kullanımını dahil etti. Öte yandan Mattei ve ark., stresle ilişkili genlerin16 ex vivo ekspresyonunu indüklemekten kaçınmak için soğuk, mekanik bir doku ayrışma protokolü sundu ve bu protokolü, hücre içi vGLUT1 boyamadan önce stresle ilişkili mikroglia yanıtının ex vivo aktivasyonunu önlemek için ilk bölümde uyarladık. Papain bazlı doku ayrışmasını takiben daha yüksek mikroglia verimini göz önünde bulundurarak in vitro sinaptozom yutma testinden önce ikinci bölümde bir enzimatik doku ayrışma protokolü kullandık (veriler gösterilmemiştir). Mikroglia, sinaptozomlarla inkübe edildiğinde kültür koşulları altında kaçınılmaz olarak 37 °C'de kalır ve 37 ° C'deinkübasyon, tüm in vitro tahlillerin ve hücre kültürü prosedürlerinin ortak dezavantajları olarak mikrogliada değişikliklere neden olabilir. Bu nedenle, sinapsların mikroglial yutulması açısından daha geniş bir sonuca varmak için sunulan her iki protokolün paralel olarak kullanılmasını öneriyoruz.
Ayrıca, beyin parankiminde bu belirteçleri de ifade eden diğer bağışıklık hücrelerinin varlığını dikkate alarak CD11b++/CD45+ mikroglia'yı seçmek için geçit stratejisini dikkatli bir şekilde tanımlamak önemlidir31. Daha da önemlisi, mikroglia'yı spesifik olarak hedeflemek için belirteçler seçerken (örneğin, TMEM119, P2RY12), patolojik ve enflamatuar koşullar32 sırasında ekspresyon seviyelerinde değişikliklere uğrayabileceklerini göz önünde bulundurmak önemlidir ve bu tür değişiklikler, sinapsların mikroglial yutulmasını ölçmek için FACS panelini oluşturmadan önce dikkate alınmalıdır. Son olarak, IHC ve mikroskopi tabanlı in vivo yaklaşımlar da dahil olmak üzere daha önce tartışılan yöntemlerin hiçbirinin, sinapsların mikroglia tarafından aktif ve seçici budanmasını tek başına yakalayamayacağını vurgulamak önemlidir. Bu yöntemler, mikroglia ile aktif budamayı beyin parankimi içindeki sinaptik kalıntıların pasif olarak temizlenmesinden ayırt edemez. Bu nedenle, verileri değerlendirirken ve tartışırken, bu farklı kavramlar arasında net bir ayrım yapmak zorunludur.

Mikroglia, merkezi sinir sisteminin (CNS) yerleşik bağışıklık hücreleridir1. Mikro çevrelerini sürekli tararlar ve gözetim sağlarlar 1,2. Ayrıca, sıklıkla sinapslarla etkileşime girerler ve sinaptik aktivitenin ince ayarına aracılık ederler3. Böylece, sinaptik arıtma sürecinde kilit bir oyuncu olarak ortaya çıktılar.
Sinapsların yutulması yoluyla sinaptik arıtmada mikroglia'nın rolü çeşitli araştırma gruplarıtarafından gösterilmiştir 3,4,5,6,7. Bu süreçteki aksaklıklar, şizofreni ve Alzheimer hastalığı gibi nörogelişimsel ve nörodejeneratif bozuklukların patolojisine katkıda bulunabilir8. Mikroglia ile anormal sinaptik arıtma, nörolojik bozuklukların çeşitli murin modellerinde zaten tespit edilmiştir 5,9,10. Bu nedenle, sinapsların mikroglial yutulmasının altında yatan farklı mekanizmaların tanımlanması, nörogelişimsel ve nörodejeneratif bozuklukların patofizyolojisini anlamak için çok önemlidir8.
Sinapsların mikroglial yutulmasını hedeflemek, hem hastalığın ilerlemesine müdahale etmek hem de nörogelişimsel ve nörodejeneratif bozuklukların altında yatan mekanizmalar hakkında bilgi edinmek için büyük bir potansiyele sahiptir. Bu tür araştırmaları kolaylaştırmak için hızlı ve yüksek verimli yaklaşımlara ihtiyaç vardır. Mevcut metodolojik yaklaşımlar, mikroglia içindeki sinaptik materyalin saptanmasını sağlayan in vivo, ex vivo ve in vitro tahlilleri kapsar. Genel olarak, sinapsların mikrogliyal yutulmasının tespiti, büyük ölçüde immünohistokimyaya (IHC) ve mikroskopi tabanlı yaklaşımlaradayanır 5,6,11, emek yoğun olan ve çok sayıda mikroglia'nın analizinde sınırlamalar gösteren.
Bu teknik sınırlamalar göz önüne alındığında, alternatif metodolojilerin araştırılması zorunludur. Bunun üstesinden gelmek için, sinapsların mikroglial yutulmasının verimli, tarafsız ve yüksek verimli bir analizini sağlayan akış sitometrisi tabanlı bir yaklaşımı optimize ettik. Yüksek derecede sinaptik yeniden şekillenme ve plastisite12 nedeniyle hipokampusu ana ilgi alanı olarak seçtik, ancak protokol çeşitli beyin bölgelerine uyarlanabilir. Akış sitometrisi, sinapsların 13,14,15 mikroglial yutulmasını tespit etmek için önceki çalışmalarda zaten kullanılmış olsa da, burada şu anda ticari olarak temin edilebilen, florofor konjuge vGLUT1 antikorunu kullanan adım adım bir metodoloji sunuyoruz. Ayrıca, ham sinaptozomlar kullanarak sinaptik materyalin mikroglial yutulmasının yüksek verimli taraması için tamamlayıcı bir in vitro yaklaşım sunuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL Dounce Homogenizer</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>Cat# 40401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Cat# 0030119452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD11b</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat# 25-0112-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CD45</td>
			<td>BD</td>
			<td>Cat# 559864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6C</td>
			<td>BD</td>
			<td>Cat# 553104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ly6G</td>
			<td>BD</td>
			<td>Cat# 551460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>Cat# 23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>Cat# 130-096-334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>Cat# 130-093-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD16/CD32 Antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#14-0161-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm Kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>Cat# 554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>Cat# 14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Round-Bottom Polystyrene Test Tubes&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 08-771-23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fixable viability dye</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# L34969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hibernate A medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# A1247501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS-columns</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>Cat# 130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>Cat# LK003150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>Cat# 17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# 11339283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodoRed</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# P36600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor</td>
			<td>Roche</td>
			<td>Cat# 5892970001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Cat# 11814389001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop E-GP Sterile Filtration System</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Cat# SEGPT0038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SynPer Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Cat# 87793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vGLUT1 Antibody</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>Cat# 130-120-764</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of microglial engulfment of synaptic material using flow cytometry

Mikroglia, beyindeki sinaptik arıtmada çok önemli bir rol oynar. Sinapsların mikroglial yutulmasının analizi, bu süreci anlamak için esastır; bununla birlikte, immünohistokimya (IHC) ve görüntüleme gibi sinapsların mikroglial yutulmasını tanımlamak için şu anda mevcut yöntemler zahmetli ve zaman alıcıdır. Bu zorluğun üstesinden gelmek için, burada akış sitometrisi kullanarak sinapsların mikroglial yutulmasının hızlı ve yüksek verimli nicelleştirilmesine izin veren in vitro ve in vivo* tahlilleri sunuyoruz.
İn vivo* yaklaşımda, vGLUT1+ sinapslarının mikroglia tarafından yutulmasını ölçmek için yetişkin fare beyinlerinden taze hücre izolasyonunu takiben hücre içi vGLUT1 boyama gerçekleştirdik. In vitro sinaptozom yutma testinde, pHrodo Red etiketli sinaptozomların mikroglia tarafından yutulmasını ölçmek için yetişkin fare beyninden yeni izole edilmiş hücreler kullandık. Bu protokoller birlikte, sinapsların mikroglial yutulmasını ölçmek için zaman açısından verimli bir yaklaşım sağlar ve emek yoğun görüntü analizi tabanlı yöntemlere umut verici alternatifler sunar. Analizi kolaylaştırarak, bu tahliller, farklı hastalık modellerinde sinaptik arıtmada mikroglia'nın rolünün daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilir.

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS)1. They constantly scan their microenvironment and provide surveillance1,2. Moreover, they frequently interact with synapses and mediate a fine-tuning of the synaptic activity3. Thus, they have emerged as a key player in the process of synaptic refinement.
The role of microglia in synaptic refinement through the engulfment of synapses has been shown by various research groups3,4,5,6,7. Disruptions in this process can contribute to the pathology of neurodevelopmental and neurodegenerative disorders such as schizophrenia and Alzheimer&#39;s disease8. Aberrant synaptic refinement by microglia has already been detected in various murine models of neurological disorders5,9,10. Therefore, identification of distinct mechanisms underlying microglial engulfment of synapses is paramount to understanding the pathophysiology of neurodevelopmental and neurodegenerative disorders8.
Targeting microglial engulfment of synapses holds great potential for both intervening in disease progression and gaining insights into the underlying mechanisms of neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. To facilitate such investigations, there is a need for fast and high-throughput approaches. Current methodological approaches encompass in vivo, ex vivo, and in vitro assays that enable the detection of synaptic material within microglia. Generally, the detection of microglial engulfment of synapses relies heavily on immunohistochemistry (IHC) and microscopy-based approaches5,6,11, which are labor-intensive and show limitations in analyzing a large number of microglia.
Given these technical limitations, the exploration of alternative methodologies is imperative. To overcome this, we have optimized a flow cytometry-based approach, which enables an efficient, unbiased, and high-throughput analysis of microglial engulfment of synapses. We chose the hippocampus as the main region of interest due to its high degree of synaptic remodeling and plasticity12, but the protocol can be adapted to various brain regions. While flow cytometry has already been used in previous studies to detect microglial engulfment of synapses13,14,15, we herein provide a step-by-step methodology employing a currently commercially available, fluorophore-conjugated vGLUT1 antibody. We, moreover, provide a complementary&#160;in vitro approach for high-throughput screening of microglial engulfment of synaptic material by using crude synaptosomes.

Yazar Spotlight: Psikonöroimmünolojide Teknolojik Yenilikler Yoluyla Anlayışı Geliştirme

Akış Sitometrisi Kullanılarak Sinaptik Materyalin Mikroglial Yutulmasının Miktar Tayini

Our research focus is on psychoneuroimmunology and we investigate the crosstalk of the immune system with the brain and the mind. I'm particularly interested in deciphering subgroups of patients based on their immune status to find tailored treatments for them. Recent developments in our field include, for instance, the development of PET ligands, but also include advanced technologies such as RNA sequencing, single cell RNA sequencing, and spatial RNA sequencing to decipher immune-based therapies.Our protocol addresses the challenge of quantifying microglial engulfment of synaptic material, which is crucial to understand the role in brain function as well as in disease pathology. Our protocol offers a fast and reliable quantification of engulfed synaptic material by microglia, and therefore provides insights into functional activity of microglia. Our protocol will inspire other research groups to include more functional assays in their research, such as engulfed motosynaptosomes, and this will lead a better and more comprehensive understanding of the role of microglia in neuroimmune interactions.

Bu projede, sinapsların mikroglia tarafından in vivo* ve in vitro yutulmasını ölçmek için iki protokolü optimize ettik ve sunduk. İlk protokolde, vGLUT1 pozitif sinapsların in vivo* yutulmasına odaklandık. Başlangıç noktası olarak, daha önce yayınlanmış bir protokol14'ü kullandık. Bununla birlikte, bu protokolde kullanılan FACS antikorları kesildi ve mikroglia izolasyonu için yeni bir yöntemin yanı sıra birçok optimizasyon adımı ekledik16. Bu nedenle, burada sunulan protokol, daha önce yayınlanmış olan protokollere kapsamlı bir güncelleme olarak bilim camiasıyla paylaşılmaya değer.
Sinapsların mikroglial yutulmasını ölçmek için, 11-14 haftalık C57BL / 6N erkek fareler kullandık. Hipokampus, yüksek derecede sinaptik yeniden şekillenme ve plastisite12 nedeniyle ana ilgi alanı olarak seçilmiştir. C57BL / 6N farelerinin hipokampusunda %vGLUT1 pozitif mikroglia ve mikrogliaya özgü vGLUT1-PE floresan yoğunluğunu (MFI) analiz ettik. Aynı hayvanlardan elde edilen dalak makrofajları, deney başına biyolojik negatif kontrol olarak kullanıldı. İzotip kontrolü ve dalak makrofajlarına kıyasla hipokampal mikrogliadan daha yüksek bir vGLUT1-PE floresan sinyali göstererek vGLUT1 antikorunu test ettik (Şekil 1B-E)
Ayrıca, beyincikteki ve koku soğancığındaki sinapsların mikroglial yutulmasını karşılaştırdık (yüksek sinaptik plastisite için başka bir referans olarak)20. Koku soğancığından gelen mikrogliada daha yüksek bir vGLUT1 floresan sinyali ve beyincikte hipokampusa kıyasla daha düşük bir sinyal bulduk (Şekil 1F). En düşük sinyal yoğunluğu dalak makrofajlarında tespit edildi ve iç negatif kontrol görevi gördü (Şekil 1E). Ek olarak, vGLUT1 antikorunuzun immünoreaktivitesini test etmek için Vglut-IRES-Cre / ChR2-YFP fareleri kullandık. YFP, bu farelerin glutamaterjik nöronları tarafından ifade edilir, bu da YFP pozitif popülasyonun ayrıca bir vGLUT1 pozitif fraksiyon içermesi gerektiğini gösterir. Bu boyama protokolünü kullanarak, YFP pozitif popülasyonun %98,7'sini vGLUT1 pozitif olarak tespit ettik ve antikorun etkinliğini doğruladık (Ek Şekil S3).
Genel olarak, bu sonuçlar vGLUT1 antikorunun etkinliğini ve sunulan boyama protokolünü doğrular. Bu protokolün ve antikorun, diğer deneysel yaklaşımlara kıyasla sinapsların in vivo* yutulmasını yüksek verimli ve hızlı bir şekilde ölçmek için güvenle kullanılabileceğini gösteriyoruz.
İn vitro yönteme geçerek, yetişkin mikrogliaları izole ettik ve in vitro yutulmalarını ölçmek için aynı hayvanlardan izole edilen taze izole edilmiş pHrodo Red etiketli sinaptozomlarla inkübe ettik (Şekil 2A). Sinaptozomları, asidik çevreleyen pH21'deki floresan sinyalini doğal olarak artıran pHrodo Kırmızısı ile etiketledik. Sinaptozomları taze izole ettik ve farklı pH değerlerine maruz bıraktık (pH = 4 ve pH = 11). Bir prensip kanıtı deneyi olarak düşük pH'da floresan sinyalindeki artışı doğruladıktan sonra (Şekil 2B), bu sinaptozomları 1.5-2 saat boyunca yeni izole edilmiş mikroglia ile inkübe ettik. Bir kontrol olarak, mikroglia'yı etiketlenmemiş sinaptozomlarla inkübe ettik. Daha sonra, CD11b++/CD45+ mikrogliasından pHrodo Red-PE floresan sinyalini analiz ettik ve pH = 4'te sinaptozomlardan elde edilenle karşılaştırılabilir pozitif bir PE floresan gözlemledik (Şekil 2C). Bu nedenle, bu yöntem, sinaptozomların in vitro yutulmasının hızlı ve yüksek verimli bir analizini sağlar ve gerekli optimizasyon adımlarını takiben amiloid plaklara veya diğer potansiyel hedeflerin yutulmasına kadar genişletilebilir. Nitekim, Rangaraju ve ark. benzer bir akış sitometrisi tabanlı yaklaşım kullanarak amiloid beta'nın mikroglia tarafından yutulmasını ölçtü22. Sonuç olarak, bu iki yöntem, hem in vivo* hem de in vitro olarak sinapsların mikroglial yutulmasının sağlam, verimli ve yüksek verimli miktar tayinini sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66639/66639fig01v4.jpg"> Şekil 1: vGLUT1+ sinapslarının mikroglial yutulmasının in vivo analizi*. (A) Hücre içi vGLUT1 boyamanın adımlarını gösteren deneysel iş akışının grafiksel gösterimi. (B) Hipokampustan tek/CD11b++/CD45+/ canlı hücre popülasyonunu tanımlamak için geçit stratejisi. Bu popülasyon, vGLUT1-MFI'yi analiz etmek ve hipokampustaki vGLUT1 + mikroglia yüzdesini ölçmek için kullanıldı. Kırmızı dikdörtgen ile gösterilen kapı, toplam numunedeki vGLUT1+ hücre fraksiyonunu gösterir. (C) Histogram, vGLUT1-PE floresan yoğunluğunu gösterir. (D) Kırmızı dikdörtgen ile gösterilen kapı, İzotip-PE immünoreaktivitesini gösteren pozitif hücre fraksiyonu olmadığını gösterir. Histogram, Isotype-PE floresan yoğunluğunu gösterir. (E) Kırmızı dikdörtgen ile gösterilen kapı, dalak makrofajlarında vGLUT1-PE immünoreaktivitesi gösteren pozitif hücre fraksiyonu olmadığını gösterir. Histogram, vGLUT1-PE floresan yoğunluğunu gösterir. Histogramda belirtilen kapı, dalaktan gelen vGLUT1-MFI'nin sona erdiği seviyede (~ 104) başlar ve beyin örneklerinde vGLUT1 pozitif fraksiyonunu analiz etmek için kullanılır. (F) Üst üste binen histogram, dalak makrofajlarının (gri) ve hipokampus (kırmızı), beyincik (mor) ve koku soğancığından (açık mavi) gelen mikrogliaların PE floresan yoğunluğunun karşılaştırmasını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66639/66639fig02.jpg"> Şekil 2: Sinaptozom sinapslarının in vitro mikroglial yutulmasının analizi. (A) İn vitro sinaptozom yutma testinin adımlarını gösteren deneysel iş akışının grafiksel gösterimi. (B) İki farklı pH değerinde inkübe edilen sinaptozomlar, pH = 11'de düşük pHrodo Red-PE floresan sinyali ve pH = 4'te yüksek pHrodoRed-PE floresan gösterir. (C) pHrodo Red-PE floresan yoğunluğunu analiz etmek için tek / CD11b ++ / CD45 + hücre popülasyonu kullanıldı. Negatif kontrol olarak boyanmamış sinaptozomlarla inkübe edilen mikroglia kullanıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: Bu protokolde kullanılan tamponların ve reaktiflerin listesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_table%201.zip" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S1: Yeni izole edilmiş yetişkin mikroglia'nın temsili görüntüsü. Papain bazlı doku ayrışma protokolünü ve CD11b+ mikroglia'nın MACS bazlı izolasyonunu takiben 20x objektifli bir ışık mikroskobu kullanılarak elde edilen görüntü. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-1.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S2: Dalak makrofajlarını tanımlamak için geçit stratejisini gösteren temsili FACS grafikleri. Dalak, hipokampustaki sinapsların mikroglial yutulmasını test ederken, deneysel çalışma başına deneylerde negatif bir kontrol olarak kullanıldı. Yukarıda verilen FACS grafikleri, dalak makrofajlarını CD11b++/CD45++/yaşayabilir popülasyon olarak tanımlar. Bu popülasyon, bu eşik kapısının üzerinde bulunan beyin örneklerinde vGLUT1 + mikrogliasını ölçmek için bir eşik belirlemek için kullanıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-2.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S3: vGLUT1 antikorunun etkinliğini test etmek için geçit stratejisini gösteren temsili FACS grafikleri. (A) vGLUT1 boyamanın adımlarını gösteren deneysel iş akışının grafiksel gösterimi. vGLUT1 antikorunun immünoreaktivitesini test etmek için YFP + glutamaterjik nöronlar kullanıldı. (B) vGLUT1 FACS antikorunun etkinliğini test etmek için pozitif bir kontrol olarak kullanılan Vglut-IRES-Cre // ChR2-YFP farelerinin hipokampüsünden YFP + popülasyonunu tanımlamak için geçit stratejisi. Glutamaterjik sinapsları belirlemek için YFP+ fraksiyonu kapılandı. Bu popülasyonda, antikorun immünoreaktivitesini test etmek için vGLUT1 antikorunun immünoreaktivitesi analiz edildi. (C) İzotip kontrolü ile karşılaştırıldığında; YFP pozitif hücre fraksiyonunun %97.9'u (D) vGLUT1 pozitif olarak tespit edilir. (E) Üst üste binen histogram, izotip ve vGLUT1 antikoru arasındaki PE floresansının karşılaştırmasını gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-3.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada, akış sitometrisi kullanarak vGLUT1 pozitif sinapsların ve pHRodo Red etiketli ham sinaptozomların mikroglial yutulmasını ölçmek için iki protokol sunuyoruz.

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

Araştırma odağımız psikonöroimmünoloji üzerinedir ve bağışıklık sisteminin beyin ve zihin ile karışmasını araştırıyoruz. Özellikle, onlar için özel tedaviler bulmak için bağışıklık durumlarına göre hasta alt gruplarını deşifre etmekle ilgileniyorum. Alanımızdaki son gelişmeler, örneğin PET ligandlarının geliştirilmesini içerir, ancak aynı zamanda bağışıklık temelli tedavileri deşifre etmek için RNA dizilimi, tek hücreli RNA dizilimi ve uzamsal RNA dizilimi gibi ileri teknolojileri de içerir.Protokolümüz, beyin fonksiyonunun yanı sıra hastalık patolojisindeki rolünü anlamak için çok önemli olan sinaptik materyalin mikroglial yutulmasını ölçme zorluğunu ele almaktadır. Protokolümüz, mikroglia tarafından yutulan sinaptik materyalin hızlı ve güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlar ve bu nedenle mikroglia'nın fonksiyonel aktivitesi hakkında bilgi sağlar. Protokolümüz, diğer araştırma gruplarına, yutulmuş motosinaptozomlar gibi araştırmalarına daha işlevsel tahliller eklemeleri için ilham verecek ve bu, mikroglia'nın nöroimmün etkileşimlerdeki rolünün daha iyi ve daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına yol açacaktır.

quantification-microglial-engulfment-synaptic-material-using-flow

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

539 Görüntüleme.  Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association. Araştırma odağımız psikonöroimmünoloji üzerinedir ve bağışıklık sisteminin beyin ve zihin ile karışmasını araştırıyoruz. Özellikle, onlar için özel tedaviler bulmak için bağışıklık durumlarına göre hasta alt gruplarını deşifre etmekle ilgileniyorum. Alanımızdaki son gelişmeler, örneğin PET ligandlarının geliştirilmesini içerir, ancak aynı zamanda bağışıklık temelli tedavileri deşifre etmek için RNA dizilimi, tek hücreli RNA dizilimi ve uzams...