Genel araştırmamız, protein aktivitesinin ışıkla hassas uzay-zamansal kontrolünü sağlayan optogenetik yöntemler geliştirmeye odaklanmaktadır. Allosterik regülasyon için lightR adı verilen hafif düzenlenebilir alanlar tasarlıyoruz, bu da mekansal-zamansal olarak kontrol edilen protein aktivitesinin hücresel sinyalizasyonu nasıl etkilediğini ve klinik öncesi hastalık modellemesi ve tedavi geliştirmeye yardımcı olan işlevleri incelememize olanak tanıyor. Optogenetik, hedef protein aktivitesinin hassas ve geri dönüşümlü kontrolünü sağlamak ve endojen sinyal kinetiğini doğru bir şekilde taklit etmek dahil olmak üzere çeşitli zorluklarla karşı karşıyadır.
Temel sorunlar, istenmeyen aktivasyonu önlemek, hedeflenen hücre altı aktivasyonu sağlamak ve hücre canlılığını korumak için fototoksisiteyi yönetmektir. Ek olarak, evrensel olarak uyumlu ve sağlam araçlar geliştirmek, uygulamalarda çok yönlülüğü ve tekrarlanabilirliği artırmak için çok önemlidir. LightR araçlarının mühendisliğine yönelik protokolümüz, allosterik düzenleme, yüksek hassasiyet, uzamsal çözünürlük, sıkı zamansal kontrol ve hassas sinyalizasyon özgüllüğü dahil olmak üzere çok sayıda gelişmiş özelliği tek bir sistemde benzersiz bir şekilde birleştirir.
Bu entegrasyon, çeşitli hedef proteinler arasında ayarlanabilirliğe izin vererek, bu kritik yeteneklerden bir veya daha fazlasına sahip olmayan diğer yöntemlerdeki boşlukları giderir. Hücre göçünü düzenleyen temel sinyalizasyon ve yapısal süreçleri tanımlamakla ilgileniyoruz. Optogenetik teknolojimizi, endotel hücre göçü ve etkileşimlerinin düzenlemelerini incelemek için kullanmayı amaçlıyoruz.
Hücre dışı matriksin yeniden şekillenmesinin endotel hücreleri tarafından nasıl aracılık ettiğini anlayın ve bu süreçlerin düzensizliğinin hastalık gelişimine nasıl katkıda bulunduğunu belirleyin. LightR kinazların biyokimyasal analizi için, her deney grubu için 3.5 santimetre hücre kültürü kabı için altı lin XE hücresinin gücüne bir kez 10 kez plaka, hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 16 ila 18 saat inkübe edin. Ertesi gün, uygun bir transfeksiyon reaktifi kullanarak seçilen DNA yapısı ile hücreleri transfekte edin.
Çanağı alüminyum folyo ile örtün ve inkübatöre geri koyun. 16 ila 18 saatlik transfeksiyondan sonra, doku kültürü inkübatörünün içine 465 nanometre LED panel lamba sistemi yerleştirin. Santimetre kare başına üç miliwatt'lık bir aydınlatma elde etmek için delikli bir pleksiglas paneli lambanın 10 santimetre yukarısına yerleştirin.
LightR-Src ve D388 R-LightR-Src ifade eden hücrelerde sürekli aydınlatma kullanın. Aydınlatmayı kontrol etmek için LED paneli manuel olarak açın ve kapatın. Deney zaman noktalarının sonunda, hücreleri güvenli kırmızı ışık altında hasat edin, ortamı aspire edin ve hücreleri soğuk PBS ile yıkayın.
Lin XE hücrelerinin 60 dakika boyunca tasarlanmış LightR-Src ile küresel aydınlatması, katalitik inaktif D388 RLightR-Src mutantını eksprese eden Src substratlarının, endojen paxillin ve p130Cas hücrelerinin fosforilasyonunu gösterir. Başlamak için, hücre kültürü ortamında 35 milimetre doku kültürü kabı başına beş hela hücresinin gücüne iki kez 10 kez plakalayın. Hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte iki saat inkübe edin.
Hücreler bağlandıktan ve %60 ila %70 birleşmeye ulaştığında, hella hücrelerini verilen karışımla birlikte geçirin. Hücrelerin yanlışlıkla yanmasını önlemek için çanağı alüminyum folyo ile örtün. Daha sonra hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 16 ila 18 saat inkübe edin.
Daha sonra, 25 milimetre çapında ve 0.17 milimetre kalınlığında kapalı camları altı kuyulu bir plaka odasına yerleştirin. PBS'de litre başına beş miligram fibronektin ile üç yuvarlak cam kapak fişini kaplayın ve gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra kapak fişlerini transfeksiyondan 16 ila 18 saat sonra PBS ile durulayın.
Transfekte edilmiş hela hücrelerini güvenli, kırmızı ışıkta toplayın, daha sonra güvenli, kırmızı ışık altında her bir kapak kaymasında beş transfekte edilmiş hela hücresinin gücüne yaklaşık bir kez 10 kez oynatın. Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve hücre kültürü ortamında 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte iki saat inkübe edin. Daha sonra, hazırlanan görüntüleme ortamını ve mineral yağı 37 santigrat dereceye ısıtın.
Daha sonra hücreleri içeren kapak fişlerini PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri boyadıktan ve yıkadıktan sonra, kapak fişini dikkatlice canlı bir hücre görüntüleme odasına yerleştirin. Hazneye bir mililitre L15 görüntüleme ortamı ekleyin.
Görüntüleme sırasında buharlaşmayı önlemek için ortama bir mililitre önceden ısıtılmış mineral yağ ekleyin. Görüntüye hazır olana kadar odayı 37 santigrat derecede ışıktan koruyun. Odayı önceden 37 santigrat dereceye ısıtılmış bir mikroskop sahnesine yerleştirin.
Hem hızlı LightR-Src kirazını hem de Src bir IRFP'yi ifade eden tek bir hücre seçin. Aydınlatmak için hücre içindeki belirli ilgi alanlarını seçin. Bu etüt için, seçilen hücrenin çevresinde küçük bir alan seçin.
Seçilen hücreyi, aydınlatmadan önce bazal durumda 20 dakika boyunca her dakika görüntüleyin. Yerel olarak aydınlatırken 50 dakika boyunca görüntülemeye devam edin, ardından aktivasyondan 20 dakika sonra toplam 90 dakika boyunca devam edin. Görüntülemeden sonra, analiz için filmleri tif yığın dosya biçiminde kaydedin.
Hela hücrelerinin küresel aydınlatması, mavi ışık kapatıldığında tersine çevrilen fokal yapışmalara hızlı LightR-Src'nin lokalizasyonuna yol açtı. Bu aydınlatma aynı zamanda mavi ışık kapatıldığında duran hücre yayılmasında önemli bir artışa neden oldu. Katalitik inaktif D388 R-LightR-Src mutantı hücre yayılması göstermedi.
Hızlı LightR-Src eksprese eden hela hücrelerinin lokalize aydınlatması, yapının fokal adezyonlarda birikmesine neden oldu ve 50 dakikalık aydınlatma ile lokalize membran çıkıntılarına yol açtı. Aydınlatmadan sonraki 20 dakikalık karanlıkta başka bir alan kazanımı gözlenmedi. Hızlı LightR-Src, karanlık fazdaki fokal yapışmalardan yavaş yavaş kayboldu.
Hücre merkezi aydınlatılmış bölgeye doğru kaydı. Hızlı LightR-Src aktivasyonunu takiben, yönlendirilmiş hücre hareketini gösterir.
