Çoğu sağlık durumu erken tespit edilirse daha iyi yönetilebilir. Erişilebilir vücut sıvılarında bulunan biyobelirteçler, sağlık durumlarının erken tespiti için en umut verici yollardır. İnsan beyninden küçük hücre dışı veziküller yoluyla salınan mikroRNA biyobelirteçlerini araştırma yöntemlerindeki gelişmeleri bildiriyoruz.
Bu yöntem, demans gibi farklı genetik hastalık alt tipleri arasındaki küçük hücre dışı vezikal kargolardaki varyasyonu tanımlamamıza, periferik sıvılarda tespit edilebilecek kargo biyobelirteç adaylarını tanımlamamıza ve hastalığın erken teşhisini geliştirmemize olanak sağlamıştır. Dolayısıyla bu protokol verimliliği, erişilebilirliği ve ürün saflığını dengeleyerek farklı laboratuvar ortamlarında kolayca tekrarlanabilir hale getirir. Herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve önceden paketlenmiş sütunlar tutarlılık sağlar.
Bu nedenle, herhangi bir biyobelirteç bulgusu istenen bir klinik sonuca kolayca çevrilecektir. Yeni hastalık modifiye edici ilaçların onaylanmasıyla, hasta yararını en üst düzeye çıkarmak için teşhisin bu hastalıkları şu anda mümkün olandan çok daha erken alması gerekir. Bunun gibi yöntemler, hastalıkla ilgili yeni mikroRNA biyobelirteçlerinin tanımlanmasına yol açacak ve bu da spesifik tedavi ve bakım seçenekleri kullanılarak daha iyi sağlık yönetimi ile sonuçlanabilecektir.
Vücut sıvılarında bulunan heterojen bir karışım içinde belirli bir hücre tipinden salınan mikroRNA biyobelirteçlerini tespit edebilen doku ve hücre tipine özgü belirteçleri tanımlamak için yöntemler geliştirmek için mevcut yeteneklerimizi kullanacağız. Başlamak için, soğuk bir plaka üzerinde sterilize edilmiş bir neşter kullanarak 250 miligram donmuş beyin dokusunu ince bir şekilde dilimleyin. Dokuya hazırda bekletme çözeltisinde mililitre başına 75 birim kollajenaz Tip III iki mililitre ekleyin.
Her numuneyi 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin. Beş dakikalık işarette, karıştırmak için numuneyi iki kez ters çevirin. 10 dakikalık işarette, 10 mililitrelik plastik tek kullanımlık bir şerit kullanarak numuneyi üç kez nazikçe pipetleyin.
Daha sonra her numuneyi buzun üzerine yerleştirin ve her numuneye proteaz inhibitörü kokteyli ve fosfataz inhibitörü ekleyin. Her beyin dokusu örneğini 300G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı topla.
Ve sonra 2000G'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Şimdi süpernatanı toplayın ve 0.22 mikrometrelik bir filtreden süzün. Daha sonra süzüntüyü 10.000G'de dört santigrat derecede 48 dakika santrifüjleyin.
Süpernatanı topladıktan sonra, her numuneye iki ila bir oranında yağış tamponu ekleyin. Ve numuneyi gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra her bir numuneyi 10.000G'de dört santigrat derecede 96 dakika santrifüjleyin.
Ve peleti 100 mikrolitre hücre dışı vezikülsüz PBS'de yeniden süspanse edin. Önceden hazırlanmış boyut dışlama kromatografisini veya SEC kolonunu oda sıcaklığında 15 dakika dengeleyin. Dengelemeden sonra, koruyucu tamponu kolonun üstünden çıkarın ve kolonu 250 mikrolitre hücre dışı vezikülsüz PBS kullanarak iki kez yıkayın.
Daha sonra yeniden askıya alınmış peleti kolona ekleyin ve 30 saniye boyunca 50G'de santrifüjleyin. Akışı attıktan sonra, 180 mikrolitre EV içermeyen PBS ekleyin ve beynin türetilmiş küçük hücre dışı veziküllerin ortaya çıkmasına izin vermek için sütunu bir dakika boyunca 50G'de santrifüjleyin. Küçük hücre dışı vezikülleri bitlemek için, izole edilmiş küçük hücre dışı vezikül örneğini lizis ve ekstraksiyon tamponu ile eşit oranda seyreltin.
Seyreltilmiş numuneyi 30 dakika boyunca dört santigrat derecede çalkalayın. Daha sonra numuneyi 15 dakika boyunca 14.000G'de santrifüjleyin. Protein süpernatanı toplayın ve bir protein tahlil kiti kullanarak protein konsantrasyonlarını ölçün.
Nanopartikül izleme analizi yapmak için, her numuneyi 1 ila 1000 arasında bir seyreltme faktörü kullanarak PBS'de seyreltin. Numuneyi NTA cihazına enjekte edin. Ve cihazı, numuneyi 550 nanometre dalga boyunda okuyacak şekilde ayarlayın.
MISEV yönergelerine göre femto gram cinsinden ifade edilen parçacık başına protein miktarını ölçmek için parçacık miktarını kullanın. Daha sonra, hücre maskesi turuncusunu veya CMO boyasını PBS'de 1 ila 1000 arasında bir seyreltme faktörü ile seyreltin. Daha sonra CMO boyasını 1 ila 10 seyreltme faktörü kullanarak küçük hücre dışı vezikül numunesi ile seyreltin.
Ve karışımı karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Şimdi, CMO boya küçük hücre dışı vezikül karışımını 1 ila 1000 seyreltme faktöründe PBS kullanarak daha da seyreltin. NTA cihazını kullanarak, 550 nanometre dalga boyunda her küçük hücre dışı vezikül örneğinin CMO boyasını okuyun.
Floresan antikor takibi için, her bir tetraspan ve floresan antikoru PBS'de 1 ila 10 seyreltme faktörü kullanarak seyreltin. Daha sonra her bir antikor boyasını 1 ila 10 seyreltme faktörü kullanarak küçük hücre dışı vezikül örneği ile seyreltin. Ve karışımı karanlıkta dört santigrat derecede iki saat inkübe edin.
Daha sonra, ikinci antikor karışımını PBS kullanarak 1 ila 1000 seyreltme faktörü ile seyreltin. NTA cihazını kullanarak 550 nanometre dalga boyunda küçük hücre dışı vezikül örneğinin floresan antikor sinyallerini okuyun. Western blot analizi, beyin kaynaklı küçük hücre dışı veziküllerde CD9, CD63, CD81, Flotilla One ve TSG101 pozitif belirteçlerinin varlığını doğrularken, Calnexin yoktu ve hücresel kontaminasyon olmadığını gösterdi.
Nanopartikül izleme analizi, izole edilen parçacıkların boyutlarının 50 ila 200 nanometre arasında değiştiğini ve yaklaşık 100 nanometrede bir tepe konsantrasyonuna sahip olduğunu ortaya koydu. CMO boyama verileri, partiküllerin %52.35'inin lipid çift tabakasına sahip olduğunu, bunların %34.66'sının CD9, %15.49'unun CD63 ve %12.01'inin CD81 içerdiğini gösterdi.
