Testin başlamadan önce, aşağıdaki reaktifler doğru hazırlanmış olduğundan emin olmanız gerekir: <ol><li> 50 mM potasyum fosfat tamponu, pH 7.5. 11.4 mg / ml potasyum fosfat dibazik, arıtılmış su ve 1M HCl ile pH ayarlanması içinde trihidrat kullanarak hazırlayın. Bu çözüm, 37 ° C önceden yerleştirilmiş. </li><li> Kazein 6.5 mg / ml 50 mM potasyum fosfat tamponu karıştırılarak hazırlanan% 0,65 ağırlık / hacim kazein çözüm. Yavaş yavaş ° C yaklaşık 10 dakika boyunca homojen bir dağılım elde edilene kadar nazik karıştırma ile çözüm sıcaklığı 80-85 arttı. Bu çözüm kaynatmak için çok önemlidir. Gerekirse NaOH ve HCl ile pH ayarlanır. </li><li> 6.1N bir stok 01:55 arıtılmış su ile seyreltilmesi ile hazırlanan 110 mM Trikloroasetik asit çözeltisi,. Trikloroasetik asit güçlü bir asit ve bakım ile ele alınmalıdır. </li><li> 0.5 mM Folin &amp; Ciolcaltea ya da proteaz aktivitesi ile doğrudan ilgili olacaktır ölçülebilir bir renk değişikliği oluşturmak için tirozin ile reaksiyona girer çözümdür Folin Fenol Reaktif. Folin Fenol Reaktif bir asittir ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. </li><li> Anyhydrous sodyum karbonat 53 mg / ml saf su kullanılarak hazırlanan 500 mm Sodyum Karbonat çözüm. 5mM Kalsiyum Asetat ile 10 mM Sodyum Asetat Tamponu, pH 7.5, 37 ° oluşan bir enzimin seyreltici çözüm ° C. Bu çözüm, katı proteaz örnekleri çözülür veya enzim çözümler sulandırmak için ne kullanın. </li><li> 1.1 mM L-tirozin Standart stok solüsyonu. Arıtılmış su ve tirozin eriyene kadar hafifçe ısıtılır 0.2 mg / ml L-tirozin kullanılarak hazırlanmıştır. Kazein gibi, bu çözüm kaynatın. L-tirozin standart oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Bu çözüm, standart eğri daha seyreltilmiş olacaktır. </li><li> Proteaz çözüm. Proteaz çözülür ve kullanmadan önce hemen, 6. adımda hazırlanan enzim seyreltici çözüm. </li></ol> Gerekirse, önceden belirlenmiş bir aktivite 0.1-0.2 ünite / ml enzim seyreltici kullanılarak çözülür sağlam bir proteaz örnek, kullanın. Bu çözüm, kalite kontrol testi için bir pozitif kontrol ve enzim aktivitesini belirlemek için yapacağı hesaplamalar için doğrulama olarak hizmet vermektedir. Proteaz Testi ve Standart Eğriler ayarlama <ol><li> Bu testte başlamak için, yaklaşık 15 ml tutun uygun şişeleri bulabilirsiniz. Test edilecek her bir enzim için, 4 flakon ihtiyaç vardır. Bir flakon, bir boş olarak kullanılan olacak ve diğer üç proteaz üç dilüsyonları tahlil aktivitesi için kullanılacak. Üç dilüsyonları birbirlerine karşı son hesaplamalar kontrol ederken yararlıdır. <ol><li> Dört şişeleri her set için% 0.65 kazein çözüm 5mls ekleyin. Onları 37 yaşında bir su banyosunda dengeye ° C, yaklaşık 5 dakika. </li><li> Boş değil, test numune şişeleri üç test edilecektir enzim çözeltisi hacimleri değişen, ancak ekleyin. ° C tam on dakika dönen ve 37 inkübe karıştırın. Bu inkübasyon süresi sırasında proteaz aktivitesi ve tirozin dolaylı kurtuluş ölçülür ve test örnekleri arasında karşılaştırıldı ne olacak. </li></ol></li><li> Bu 10 dakika inkübasyondan sonra, reaksiyon durdurmak için her tüpe 5 ml TCA reaktif ekleyin. Daha sonra, her tüpe bile boş, her tüp enzim çözüm son hacmi 1 ml enzim çözeltisi uygun bir hacim kazandırmak. Bu enzim kendisi absorbans değeri hesaba ve her tüp nihai hacmi eşit olmasını sağlamak için yapılır. 37 çözümler ° C&#39;de 30 dakika için. Bu 30 dakikalık inkübasyon sırasında, tirozin standart dilüsyonları kurmak isteyebilirsiniz. 8 mls kolayca tutabilir 6 dram şişeleri (dram şişeleri polipropilen tüpler ile ikame edilebilir) kullanın. 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.50 altı şişeleri, mls aşağıdaki hacimleri ile 1.1 mM tirozin standart stok çözümleri ekleyin. Tirozin için herhangi bir standart boş katmayın. Alt standartları biraz renk değişikliği verecektir saf test örnekleri için gerekli olabilir. Tirozin standart solüsyonu ilave edildikten sonra, 2 ml hacmi getirmek için her standartlara uygun bir hacimde saf su ekleyin. </li><li> 30 dakika inkübasyondan sonra, test çözümleri her filtre ve boş bir 0.45 um polyethersulfone şırınga filtre kullanarak. Filtrasyon örneklerinden herhangi bir Çözünmezlerin kaldırmak için gereklidir. <ol><li> En az 8 ml tutabilir 4 dram şişeleri filtrasyon 2 ml test örnekleri ve boş süzüntü ekleyin. Aynı tip standartlar hazırlanmıştır flakon kullanılabilir. </li><li> Tüm standartları ve standart boş içeren flakon, sodyum karbonat 5mls ekleyin. En iyi sonuç için, hemen ardından Folin reaktifi 1 ml ekleyin. </li><li> Folin reaktif ilavesi ile oluşturulan herhangi bir pH düşüşü düzenleyen sodyum karbonat ekleyin. </li><li> Test örnekleri ve tes sodyum karbonatt boş. Bu çözümler, sodyum karbonat ilave edildikten sonra bulutlu olur. Öncelikle ücretsiz tirozin tepki vereceğini Folin reaktifi ekleyin. </li><li> Dönen tarafından dramını şişeleri karıştırın ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol> Bu inkübasyondan sonra, standartlara tirozin eklendi miktarı ile korele bir tonlama renk olduğunu fark; tirozin yüksek konsantrasyonlarda karanlık görünen. Ayrıca test örnekleri içinde kayda değer bir renk değişikliği fark edebilirsiniz. Bu çözümlerin 2mls uygun küvetler içine 0.45 um polyethersulfone şırınga filtresi kullanarak filtrelenir. Tahlil yapılır Şimdi, bizim absorbans değerleri kaydetmek için spektrofotometre devam edebilirsiniz. </li></ol> Absorbans Ölçüm ve Enzim Aktivitesi Hesaplanması <ol><li> Örneklerin absorbansı 660nm dalga boyunda bir spektrofotometre ile ölçülür. Işık yolu 1 cm olarak ayarlanır. Standartları, standart boş, farklı test örnekleri ve test boş absorbans değerleri kaydedin. Bir kez tüm verileri toplandı, standart eğri oluşturulabilir. Standart ve standart boş arasındaki absorbans eğrisi oluşturmak için, fark hesaplanması gerekmektedir. Bu standart çözümler tirozin miktarı atfedilebilecek absorbans değerdir. Bu basit bir hesaplama sonra, standart eğri, Y ekseni üzerinde standartların absorbans değişikliği, X ekseni üzerinde 5 standartlarını her mikromolden miktarına karşı komplo bir grafik programını kullanarak oluşturabilirsiniz. <table style="width: 416px; height: 118px;" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> Tirozin Standart Hacmi </th><th style="text-align:center"> uMoles Tyrosine </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,05 </td><td style="text-align:center"> 0,055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,10 </td><td style="text-align:center"> 0,111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,20 </td><td style="text-align:center"> 0,221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,40 </td><td style="text-align:center"> 0,442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0,50 </td><td style="text-align:center"> 0,553 </td></tr></tbody></table></li><li> Veri noktaları girildikten sonra, en uygun ve ilgili eğim denklemi bir çizgi oluşturur. Test örneği absorbans ve test boş absorbans arasındaki fark hesaplanarak test örnekleri absorbans değişikliğini bulun. Eğim denklemi içine bir test örnekleri için absorbans değeri takma ve çözme bu özel proteolitik reaksiyon sırasında tirozin kurtarılmış mikromolden neden olacaktır. / Ml başına birim enzim aktivitesi elde etmek için, aşağıdaki hesaplama gerçekleştirin: (Tirozin umole eşdeğerleri piyasaya) x (11) Birimler / ml Enzim = __________________________________________ (1) x (10) x (2) Testin 11 = Toplam hacmi (mililitre) Testin 10 = Zaman (dakika) Birim tanımını başına 1 = Enzim enzim hacmi (mililitre) Kolorimetrik belirlenmesi kullanılan 2 = hacmi (mililitre) Eğim denklemi elde mikromolden tirozin eşdeğerleri piyasaya numarasını alın ve bizim durumumuzda 11mls olan mls, testin toplam hacmi ile çarpın. Kolorimetrik saptanmasında kullanılan mililitre hacmi, bu değeri diğer üç miktarlarda Böl: 10 dakika boyunca koştu tahlil, zaman, hacim, tayininde kullanılan enzim, (Kullanıcı 1ml kullanmak izin) çeşitli olduğu. sizin küvet göre farklılık gösterir. Biz mls 2 kullanılır. </li><li> Tirozin mikromolden &quot;birim&quot; olarak adlandırılan proteaz aktivitesi dakika verim ölçümü zaman bölünür. Biz enzim aktivitesi ünite / ml açısından bir ölçüm bırakarak, pay ve payda hacim ölçümü için birimler iptal edebilirsiniz. , Enzim seyreltici seyreltilmiş sağlam bir proteaz örnek aktivitesini belirlemek amacıyla, ünite / mg açısından aktivitesi ile bize bırakarak, mg / ml. Başlangıçta bu testte kullanılan katı konsantrasyonu ünite / ml faaliyet bölmek . Birimler / ml enzim Birimler / mg&#39;lık katı = _____________________ mg katı / ml enzim </li></ol>

<ol>
	<li>Anson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li><li>Folin, O., Ciocalteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Biol. Chem. 73, 627 (1929).</li></ol>

Biz sadece Sigma&#39;nın evrensel proteaz aktivitesi tahlil kullanarak proteaz aktivitesi analiz nasıl gösterilir ettik. Buna ek olarak, bu testte deneyler için onları almadan önce proteazlar tam aktivite olduğunu tespit ettik sağlamak için yararlıdır. Görüldüğü gibi, bu işlemi yaparken, yavaş ve onları kaynatmak için kazein ve tirozin çözümler ısı hatırlamak için büyük önem taşımaktadır. Ayrıca, hem kendi standartları ve sahip olduğunuz her test örneği için farklı boşlukları hazırlamak için önemlidir.

<table><tbody><tr><td>Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Casein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>Folin &amp;amp; Ciocalteu&#039;s Phenol Reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Carbonate, Anhydrous</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate, Trihydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine, Free Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>Protease Profiler Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>Protease Fluorescent Detection Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

sigma's non-specific protease activity assay - casein as a substrate

Proteazlar peptid bağı bölünürler. Laboratuarda, genellikle proteaz aktivitesini ölçmek ve / veya karşılaştırmak için gereklidir. Sigma&#39;nın non-spesifik proteaz aktivitesi tahlil kalite kontrol işlemleri sırasında ne proteaz aktivitesini belirlemek için standart bir prosedür olarak kullanılıyor olabilir. Bu testte, kazein, bir substrat olarak davranır. Test proteaz kazeinin sindirir, amino asit olan tirozin ile birlikte diğer amino asitler ve peptit kurtuldu. Folin ve Fenol Ciocalteus ya da Folin Kullanıcı reaktif öncelikle, ölçülebilir ve spektrofotometre bir absorbans değeri olarak ölçülen bir mavi renkli kromofor üretmek için ücretsiz tirozin ile reaksiyona girer. Kazein salgılanır tirozin, daha kromoforlar proteaz aktivitesi oluşturulan ve güçlüdür. Tirozin bilinen miktarlarda FC reaktifi ile reaksiyona girerek mikromolden tirozin miktarı ile absorbans değişiklikleri ilişkilendirmek için oluşturulan bir standart eğri, proteaz aktivitesi tarafından oluşturulan absorbans değerleri karşılaştırılır. Standart eğrisinden, proteaz örnekleri aktivitesi açısından Üniteleri, kazein dakikada serbest tirozin benzerlerinin mikromolden miktarı tespit edilebilir. Çince Bu makaleyi görüntülemek için <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">buraya tıklayın</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate at JoVE.com

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

Proteazlar peptid bağı bölünürler. Laboratuarda, genellikle proteaz aktivitesini ölçmek ve / veya karşılaştırmak için gereklidir. Sigma&#39;nın non-spesifik proteaz aktivitesi tahlil proteaz aktivitesini belirlemek için standart bir prosedür olarak kullanılıyor olabilir.

Sigma&#39;nın Non-spesifik proteaz Aktivitesi Testi - Kazein bir substrat olarak

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

<a class="grey_button" href="/video/910">
ChineseVersion
</a>

sigma-s-non-specific-protease-activity-assay-casein-as-a-substrate

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Biology

Unit 1

Alcohols and Phenols

SCIENTISTS IN ACTION

76.3K Görüntüleme.  Sigma Aldrich.  ChineseVersion 

Video: Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Biyokimya

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using electrophoresis through a resolving gel embedded with a degradable substrate. This method differs from traditional gel zymography in that a quenched fluorogenic peptide is covalently incorporated into the resolving gel instead of full length proteins, such as gelatin or casein. Use of the fluorogenic peptides enables direct detection of proteolytic activity without additional staining steps. Enzymes within the biological samples cleave the quenched fluorogenic peptide, resulting in an increase in fluorescence. The fluorescent signal in the gels is then imaged with a standard fluorescent gel scanner and quantified using densitometry. The use of peptides as the degradable substrate greatly expands the possible proteases detectable with zymographic techniques.

Here, we present a detailed protocol for a modified zymographic technique in which fluorescent peptides are used as the degradable substrate in place of native proteins. Electrophoresis of biological samples in fluorescent peptide zymograms enables detection of a wider range of proteases than previous zymographic techniques.

Floresan peptid Zymography tarafından proteaz aktivitesinin algılama

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Kanser Araştırmaları

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often viruses exhibit cell and tissue tropism and are adapted to specific cell or tissue proteases. Moreover, these viruses can introduce mutations or insertions into their genome during replication that may affect the cleavage, and thus can contribute to adaptations to a new host. Here, we present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of peptides mimicking the cleavage site of viral fusion proteins. The technique is very flexible and can be used to investigate the proteolytic activity of a single protease on many different substrates, and in addition, it also allows exploration of the activity of multiple proteases on one or more peptide substrates. In this study, we used peptides mimicking the cleavage site motifs of the coronavirus spike protein. We tested human and camel derived Middle East Respiratory Syndrome coronaviruses (MERS-CoV) to demonstrate that single and double substitutions in the cleavage site can alter the activity of furin and dramatically change cleavage efficiency. We also used this method in combination with bioinformatics to test furin cleavage activity of feline coronavirus spike proteins from different serotypes and strains. This peptide-based method is less labor- and time intensive than conventional methods used for the analysis of proteolytic activity for viruses, and results can be obtained within a single day.

We present a fluorogenic peptide cleavage assay that allows a rapid screening of the proteolytic activity of proteases on peptides representing the cleavage site of viral fusion peptides. This method can also be used on any other amino acid motif within a protein sequence to test for the protease activity.

Bir Fluorogenic peptid bölünme tahlil için proteolitik aktivite ekran: coronavirus uygulamalarda spike protein etkinleştirme

Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect protease activity uses casein labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC) as the substrate.
Protease activity results in the cleavage of the FITC-labeled casein substrate into smaller fragments, which do not precipitate under acidic conditions. After incubation of the protease sample and substrate, the reaction is acidified with the addition of trichloroacetic acid (TCA). The mixture is then centrifuged with the undigested substrate forming a pellet and the smaller, acid soluble fragments remaining in solution. The supernatant is neutralized and the fluorescence of the FITC-labeled fragments is measured.
The described kit procedure detects the trypsin protease control at a concentration of approximately 0.5 &mu;g/ml (5 ng of trypsin added to the assay). This sensitivity can be increased with a longer incubation time, up to 24 hours. The assay is performed in microcentrifuge tubes and procedures are provided for fluorescence detection using either cuvettes or multiwell plates.

The Protease Fluorescent Detection Kit is designed for the measurement of protease activity using fluorometry. It is also suitable for detection of trace amounts of protease contamination. The method is based on the proteolytic hydroysis of a proprietary formulation of a FITC-labeled casein substrate.

Proteaz Aktivitesi belirleme Proteaz Floresan Algılama Kit kullanın

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

Biyoloji

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Glukan Fosfatazların Substrat Bağlanmasını Ölçmek için Konkanavalin A Bazlı Sedimantasyon Testi

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

Zymography Fonksiyonel Matrix Metalloproteinazlar Tespiti

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues Using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to inflammation and various diseases including hypertension. Detection of IsoLG accumulation in tissues is crucial in shedding light on their involvement in the disease processes. However, measurement of IsoLGs in tissues is extremely difficult, and currently available tools, including mass spectrometry analysis, are laborious and extremely expensive. Here we describe a novel method for in situ detection of IsoLGs in tissues using alkaline phosphatase-conjugated D11 ScFv and a recombinant phage-display antibody produced in E. coli by immunofluorescent microscopy. Four controls were used for validating the staining: (1) staining with and without D11, (2) staining with bacterial periplasmic extract with the alkaline phosphatase linker, (3) irrelevant scFV antibody staining, and (4) competitive control with IsoLG prior to the staining. We demonstrate the effectiveness of the alkaline phosphatase-conjugated D11 in both human and mouse tissues with or without hypertension. This method will likely serve as an important tool to study the role of IsoLGs in a wide variety of disease processes.

This article provides a detailed methodology for the measurement of isolevuglandins in tissues by immunofluorescence using alkaline phosphatase-conjugated ScFv D11 antibody. Hypertension models in both mice and humans are used to explain the step-by-step procedures and fundamental principles associated with isolevuglandin measurement in tissue samples.

D11 scFv-alkalen fosfataz füzyon proteini ve immünofloresan kullanılarak dokulardaki izolevuglandinlerin doğrudan tespiti

Isolevuglandins (IsoLGs) are highly reactive gamma ketoaldehydes formed from H2-isoprostanes through lipid peroxidation and crosslink proteins leading to ...

A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen the Proteolytic Activity of Proteases

Source: Jaimes, J. A., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58892">A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates an assay to screen for the proteolytic activity of proteases using fluorogenic peptides. The protease recognizes its cleavage site on the peptide, cleaving it and separating the quencher from the fluorophore, enabling its fluorescence emission. The fluorescence signal is detected and analyzed to check for the cleavage efficiency of different peptide variants.

Sigma'nın Non-spesifik proteaz Aktivitesi Testi - Kazein bir substrat olarak

Transkript

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST