Name: detection and isolation of viable mouse il-17-secreting t cells
Uploaded: 2008-12-18T00:00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells at JoVE.com

<p class="jove_step"> Preparar os Reagentes </p><ol><li> Faça um buffer contendo PBS com BSA (0,5%), e 2 mM EDTA. Porque as bolhas de ar podem bloquear colunas de separação MACS, o buffer deve ser desgaseificado e armazenado a 2-8 ° C antes do uso. </li><li> Usamos meio RPMI 1640 contendo soro do mouse 5%. O meio de cultura não deve conter BSA ou FCS, uma vez que estes compostos irão alterar a especificidade de estimulação celular. </li><li> A IL-17 Rato Ensaio Secreção - Enriquecimento Celular e Kit de Detecção da Miltenyi Biotec-. O kit contém os seguintes componentes: a IL-17 Reagente Catch, a IL-17 anticorpo de detecção (Biotina), o Anti-Biotina-PE, e as microesferas de Anti-PE. </li></ol><p class="jove_step"> Estimulando a esplenócitos </p><ol><li> Este protocolo é realizado na presença de um controle negativo e positivo, como esplenócitos unstimulated e um contracoloração para células T. Este protocolo é realizado utilizando técnica estéril. </li><li> Preparar uma suspensão única célula de esplenócitos de camundongo que foram isolados usando o gentleMACS Dissociator ™. A concentração de células deve ser determinada através de contagem das células. Agregar as células em 200 × g por 10 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Após centrifugação, aspirar o sobrenadante fora do pellet utilizando uma pipeta. Não decantar o tubo para evitar a perda de sedimento. </li><li> Agora, voltar a suspender as células em meio de cultura e, em seguida, adicionar a um poço. Adicionar média suficiente para uma concentração de 10 milhões de células por mL e cinco milhões de células por centímetro quadrado. </li><li> Para estimular uma resposta imune em nossas células ressuspenso, acrescentamos ionomicina (1 mg / mL) e PMA (10 ng / mL) para a amostra e misture delicadamente a solução pipetando para cima e para baixo. Em seguida, os poços são rotulados em conformidade. </li><li> Agora, vamos incubar nossas células durante 3 horas a 37 ° C sem mistura para iniciar o período de estimulação. Proceder à análise de IL-17 três horas desde o início da estimulação, de modo plano nesse sentido. </li><li> Para interromper a secreção, as células são colocadas em gelo e coletamos as células estimuladas por delicadamente pipetando para cima e para baixo com tampão de frio. Células são então transferidos do bem a um tubo e são lavados uma segunda vez. </li><li> Para garantir que todas as células são coletadas, é uma boa idéia para verificar o seu prato sob um microscópio. Se as células ainda permanecem conectados, você pode coletar as células restantes lavando o prato com tampão de frio. Qualquer aglomerados de células na sua suspensão de células pode ser removido usando os filtros de pré-separação. </li></ol><p class="jove_step"> Rotulagem as células com reagente Trave </p><ol><li> É fundamental notar, que este teste funciona perfeitamente se inferior a 2% de IL-17 são células secretoras de presente. </li><li> Se a concentração de IL-17 células secretoras deverá ser superior a 2% ajustar volumes em conformidade. <br /><img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="figura 8" width="500" height="162" /></li><li> Uma armadilha potencial deste procedimento é a contaminação cruzada do Reagente Catch, que pode ocorrer durante a rotulagem quando o anticorpo bi-específico liga-se a uma célula T não secretores e armadilhas IL-17 secretada a partir de um linfócito vizinhos, gerando falsos positivos. </li><li> A fim de contornar este problema, é fundamental para as células esfriar antes de rotulagem e trabalhar com buffer de frio para lenta difusão de IL-17 e evitar essa contaminação cruzada. Além de manter as células frio, eles devem ser mantidos a uma concentração definida. </li><li> Para iniciar o procedimento de rotulagem, usamos 10 milhões de células em um tubo de 15 ml que pode ser fechado. Se os números mais altos de células têm de ser utilizados, simplesmente escala de todos os volumes em conformidade. Uma vez que a concentração celular ideal foi obtida, lave as células, adicionando 10 ml de tampão frio. </li><li> Girar as células em 300 × g por 10 minutos em centrífuga refrigerada (2-8 ° C). </li><li> Após centrifugação, aspirar o sobrenadante completamente usando uma pipeta. Não decantar o sobrenadante, pois isso levará a perda de células e volumes imprecisa. Repita o passo de lavagem, que consiste na adição de 10ml de solução de frio, a centrifugação, e aspiração. </li><li> Agora que temos uma pelota de pureza desejado, ressuspender as células em 80 mL de meio de cultura frio. Para classificá-los, vamos agora adicionar 20 mL de Reagente rato Pegue IL-17. </li><li> Incubar as células por 5 minutos no gelo. </li><li> Após o período de incubação 5 minutos no gelo, retire o tubo e diluir as células em 10 ml de 37 C ° média morna. Em seguida, prenda o tubo na Rotator Tubo MACSmix e incubar os tubos a 37 ° C por 45 min em movimento contínuo. Aumentando a temperatura para 37 ° C vai re-iniciar a secreção de citocinas. </li></ol><p class="jove_step"> Rotulagem as células com IL-17 anticorpo de detecção (Biotina) e Anti-Biotina-PE </p><ol><li> Após o período de secreção de 45 minutos a 37 ° C, colocar o tubo imediatamente em gelo. Isto irá parar a secreção de citocinas. A partir daqui é fundamental para manter as células no gelo.Trabalhando com tampão frio vai evitar a contaminação cruzada do Reagente Catch. </li><li> Encha o tubo com tampão de frio e centrifugar a 300xg a 2-8 ° C por 10 min. Aspirar o sobrenadante completamente. Repita o passo lavar mais uma vez. </li><li> O pellet celular é ressuspenso em 80 mL de tampão frio eo tubo é colocado sobre o gelo. </li><li> Para evitar a ligação inespecífica do anticorpo, recomendamos a adição de 10μl Reagente FcR Bloqueio e incubar no gelo por 5 min. Então adicionar 20 mL de anticorpo de detecção do rato IL-17 (Biotina), que é conjugado a biotina e incubar por 10 minutos no gelo. </li><li> Mais uma vez, lave as células como fizemos antes, adicionando 10 mL de tampão frio e centrifugar a 300xg a 2-8 ° C por 10 min. </li><li> Agora aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 80 mL de tampão frio. </li><li> Adicionar 20 mL de nosso anticorpo secundário, Anti-Biotina-PE. </li><li> Misture as células e solução de anticorpo secundário, e novamente incubar os tubos durante 10 minutos no gelo. </li><li> Uma vez que esta segunda incubação é completa, lavar as células com 10 mL de tampão fria e centrifugação. </li><li> O pellet pode agora ser ressuspendida em 500 mL de tampão frio. </li><li> Se as células têm que ser separados para análise a jusante, podem ser rotulados com magneticamente Anti-PE-micro e separada manualmente ou automatizado usando MACS Colunas e Separadores de MACS. </li><li> Completamos agora a rotulagem dos esplenócitos e estão prontos para análise. </li></ol><p class="jove_step"> Análise FACS </p><ol><li> Para nossa análise, vamos comparar os esplenócitos estimulados e desestimulados por citometria de fluxo. </li><li> Antes da análise de citometria de fluxo, as células são coradas com iodeto de propídio a 0,5 mcg / mL para deixar de fora as células mortas. O Analyzer ™ MACSQuant estava carregado com 200.000 células para cada amostra e agora estamos indo olhar os gráficos de dispersão de reatividade de anticorpos relativa nas amostras. Duas considerações importantes para a análise de células raras - como a IL-17 células positivas - por citometria de fluxo são: <ul><li> definição de um portão em linfócitos na dispersão frontal versus gráfico de dispersão lado </li><li> gating e as células mortas (coradas com iodeto de propídio) e células-B (que pode causar coloração de fundo inespecífica) para aumentar ainda mais a sensibilidade de detecção </li></ul></li><li> Usamos CD4-APC anticorpos para detectar células T e os anticorpos CD45R/B220-PerCP de detectar as células B. Nós vemos as propriedades de dispersão para frente e laterais das amostras e aplicar um portão sobre a população de linfócitos. </li><li> Um segundo portão foi aplicada a ver as células mortas e as células manchadas manchado B (eixo Y). Estas células são excluídos da análise de células T. </li><li> Neste exemplo, que é essencialmente nosso controle negativo, podemos ver que há muito poucos IL-17 CD4 T secretoras de células positivas em amostras não estimuladas - cerca de 0,003% (Figura 4). Olhando para a população de células T estimuladas, podemos ver um grande número de células CD4 positivas T que secretam IL-17 - cerca de 0,367% (Figura 5A) antes da separação e 60,76% após a separação magnética com MACS Tecnologia (Figura 5B). </li></ol>

<p> Todos os protocolos e fichas de dados estão disponíveis em www.miltenyibiotec.com. </p><p> Advertências <br /> Os reagentes contêm azida de sódio. Sob condições ácidas azida de sódio produz ácido hidrazóico, que é extremamente tóxico. Os compostos de azida deve ser diluído com água corrente antes de descartar. Estas precauções são recomendadas para evitar depósitos nas canalizações onde se podem desenvolver condições explosivas.

<p> Células TH17 desempenhar um papel integral na imunidade adaptativa e da resposta inflamatória e são um componente fundamental na condução inflamação auto-imune. </p><p> Este vídeo documenta como usar mouse Miltenyi de IL-17 Assay Secreção - Enriquecimento Celular e Kit de Detecção (PE). Ao fazer este procedimento é importante ter uma estimativa da freqüência de IL-17 em células secretoras de sua preparação célula inicial. A concentração de célula apropriada durante o período de rotulagem e secreção de citoquinas evita a contaminação cruzada por outras células em sua suspensão e garante resultados confiáveis. </p>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Mouse IL-17 Secretion Assay Cell Enrichment and Detection Kit (PE) </td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-094-213</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx</a>
</td>
</tr>
<tr>
<td>RPMI 1640</td>
<td>Medium</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-440</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>CD4-APC</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-611</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>CD8a-FITC</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-091-605</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Propidium Iodide Solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-093-233</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>FcR Blocking reagent, mouse </td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-092-575</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Dead Cell Removal Kit </td>
<td>Reagent</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-090-101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MACSmix Tube Rotator</td>
<td>Instrument</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-090-753</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>gentleMACS&#x2122; Dissociator</td>
<td>Instrument</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>130-093-235</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>autoMACS Pro Starting Kit</td>
<td>Instrument</td>
<td>Miltenyi Biotec </td>
<td>130-092-545</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>MACS Columns</td>
<td>Tool</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx</a></td>
</tr>
<tr>
<td>MACS Separator</td>
<td>Tool</td>
<td>Miltenyi Biotec</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

detection and isolation of viable mouse il-17-secreting t cells

<p class="jove_content">O MACS citocinas tecnologia Assay Secreção permite a detecção de citocinas secretadas no nível única célula e isolamento sensível viável células secretoras de citocinas. Para rotular IL-17 células secretoras de uma suspensão única célula de esplenócitos mouse está preparado e estimulado a 37 ° C com PMA / ionomicina para induzir a secreção de citocinas. Para parar células secreção são então colocados em gelo e são expostos à IL-17 Reagente Catch a anticorpos bi-específicos que se liga ao CD45 na superfície celular dos leucócitos e IL-17, uma vez que é secretada e pegou perto da superfície da célula. Secreção é então re-iniciados, aumentando a temperatura para 37 ° C e IL-17 é preso pelo reagente Catch. Secreção é, então, parou de novo, colocando as células no gelo. Para detectar a IL-17 presos, as células são incubadas com IL-17 específicos segundo anticorpo conjugado a biotina e um anticorpo anti-biotina-PE. Células podem agora ser analisadas diretamente por citometria de fluxo ou preparados para isolamento e enriquecimento através da rotulagem posterior com Anti-PE microesferas conjugados.</p>

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells at JoVE.com

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

<p class="jove_content">Este procedimento descreve a detecção e isolamento de leucócitos do mouse TH17 que ativamente secretam IL-17 com a estimulação.</p>

Detecção e isolamento de células viáveis ​​rato IL-17 Secretoras de T

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

<p>


<a class="grey_button" href="/video/1044">
ChineseVersion
</a>


<a class="grey_button" href="/video/1233">
JapaneseVersion
</a>


</p>

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification

Isolamento de células T CD4 + a partir dos nós linfáticos rato Usando Miltenyi Purificação MACS

Isolation of cells from the primary source is a necessary step in many more complex protocols. Miltenyi offers kits to isolate cells from several ...

Biologia

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Isolamento de Valvular Células Endoteliais

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation of Mouse Salivary Gland Stem Cells

Isolamento de Células-Tronco do rato das Glândulas Salivares

Mature salivary glands of both human and mouse origin comprise a minimum of five cell types, each of which facilitates the production and excretion of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

Isolamento de células primário do mouse trofoblasto e Ensaio invasão do trofoblasto

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Isolamento de células basais e células Duct submucosa Glândulas de Rato Traquéia

The large airways are directly in contact with the environment and therefore susceptible to injury from toxins and infectious agents that we breath in 1. ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

Isolamento e Cultura do mouse primárias células pancreáticas acinares

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, <i>Nepenthes</i>

Isolation of Viable Multicellular Glands from Tissue of the Carnivorous Plant, Nepenthes

Isolamento de Viável multicelular Glândulas de tecido da planta carnívora,<i> Nepenthes</i

Many plants possess specialized structures that are involved in the production and secretion of specific low molecular weight compounds and proteins. ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolamento de células de camundongo Coronária endoteliais

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Detecção e isolamento de células viáveis ​​rato IL-17 Secretoras de T

Detecção e isolamento de células viáveis rato IL-17 Secretoras de T