Name: light/dark transition test for mice
Uploaded: 2006-11-13T00:00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light/dark Transition Test for Mice at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies-in-Steun voor Young Scientists (A) (# 16680015), Grant-in-Steun voor Verkennend onderzoek (# 16653065), Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek op prioritaire gebieden (# 18023022, # 18016012 en # 18053015) van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie in Japan, Grant-in-Aid van de bevordering van de fundamentele Studies in Health Sciences van het Nationaal Instituut voor Biomedische Innovatie (NIBIO), Grant-in- Steun van Neuroinformatica Japan Center (NIJC), RIKEN

<ol><li> Het apparaat wordt gebruikt voor de licht / donker overgang test bestond uit een kooi (21x42x25 cm), verdeeld in twee delen van gelijke grootte van een partitie met de deur (Ohara &amp; Co, Tokio). </li><li> Muizen zijn ondergebracht drie tot vier per kooi in een kamer met een 12 uur licht / donker-cyclus (verlichting op 7:00) met ad libitum toegang tot voedsel en water. In het ideale geval worden twee controles en twee mutanten bij elkaar gehuisvest, door het opnieuw organiseren van de muizen, zodra ze zijn gegenotypeerd op het moment van spenen. Behavioral test is uitgevoerd 09u00-18u00 Alle kooien met muizen worden overgebracht naar het gedrag testkamer 30 minuten voordat de eerste proef begint. </li><li> Een kamer is fel verlicht door witte diodes (390 lux), terwijl de andere kamer is donker (2 lux). Muizen zijn geplaatst in de donkere kant en de deur wordt geopend automatisch 3 seconden nadat de muis wordt gedetecteerd door de infrarood camera. De deur wordt zo gebruikt dat de muizen niet het licht kamer onmiddellijk na de release met hun motivatie om te ontsnappen aan experimentator, aangezien de latency naar het licht kamer betreden kan dienen als een index van angst-achtig gedrag. </li><li> Muizen zijn vrij kunnen bewegen tussen de twee kamers met een deur open gedurende 10 minuten. De applicatie wordt gebruikt voor het verkrijgen en analyseren van de gedrags-gegevens (Image LD4) is gebaseerd op het publieke domein Image J-programma (ontwikkeld byWayne Rasband aan het National Institute of Mental Health en verkrijgbaar bij http://rsb.info.nih.gov/ij /), die werd gewijzigd door Tsuyoshi Miyakawa (beschikbaar via O&#39;Hara &amp; Co, Tokyo, Japan). </li><li> De afgelegde afstand in elke kamer, het totale aantal overgangen, de tijd doorgebracht in de elke kamer, en de latency aan het licht chamberare opgenomen door Image LD4 programma te openen. </li><li> Na elke proef zijn alle kamers schoongemaakt met super hypochloor water tot een scheeftrekking op basis van olfactorische signalen te voorkomen. </li></ol>

<ol>
	<li>Austin, C. P., Aiba, A., Takao, K., Miyakawa, T., Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T., Crawley, J. N., Crawley, J. N., Crawley, J., Goodwin, F. K., Miyakawa, T., Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36, 921-924 (2004).</li></ol>

Alle procedures werden goedgekeurd door de Animal Gebruik en onderhoud Comite van Kyoto University. Tsuyoshi Miyakawa wordt geassocieerd met VOGEL, Japan Science and Technology Agency, Saitama, Japan.

Hoewel alle van de muis genoomsequenties zijn vastgesteld, zijn de functies van de meeste van deze genen niet bekend. Gen-targeting technieken, kan echter worden gebruikt voor het verwijderen of te manipuleren een specifiek gen in muizen (Aiba et al., 2007;. Austin et al., 2004.). De invloed van een bepaald gen op een bepaald gedrag kan dan worden bepaald door het uitvoeren van gedrags-analyses van de mutante muizen (Takao en Miyakawa, 2006;. Takao et al., 2007). Als een test voor gedragsverandering fenotypering van mutante muizen, de licht / donker overgang test is een van de meest gebruikte tests om angst-achtig gedrag te meten bij muizen (Crawley, 2000). De test is gebaseerd op de natuurlijke afkeer van muizen om helder verlichte gebieden en op hun spontane verkennende gedrag in nieuwe omgevingen (Crawley, 1985). De test is gevoelig voor anxiolytische medicamenteuze behandeling (Crawley, 1985). Het apparaat bestaat uit een donkere kamer en een helder verlichte kamer. Een beperkte opening, 3 cm hoog bij 5 cm breed, verbindt de twee kamers. Muizen zijn vrij kunnen bewegen tussen de twee kamers. Het aantal vermeldingen in de lichte kamer en de duur van de tijd zijn er gebruikt als indices van helder-ruimte angst bij muizen. Het licht / donker overgang test is oorspronkelijk ontwikkeld door Crawley en collega&#39;s (Crawley en Goodwin, 1980). Er zijn twee verschillen tussen de originele versie en onze test. Ten eerste het licht kamer is groter dan de donkere kamer in de originele versie, terwijl de grootte van de twee kamers hetzelfde is in onze versie van de test. Ten tweede, in de oorspronkelijke versie, het licht kamer had geen plafond en de muren van de kamer licht transparant waren (Crawley en Goodwin, 1980), terwijl we gebruik van ondoorzichtig wit plastic voor het plafond en de wanden van het licht kamer. Deze verschillen, namelijk de omvang en de toegankelijkheid van het licht kamer, zorgen voor de simultane detectie van heldere ruimte angst als open-ruimte angst in de oorspronkelijke versie van de test. In ons laboratorium, echter, open-space angst-achtig gedrag bij muizen is getest in een verhoogde plus doolhof. De ondoorzichtige muren en het plafond, de grootte van het licht kamer, en onze specifieke licht / donker overgang testprotocol is meer gespecialiseerd voor het detecteren van licht-space angst ten opzichte van de originele versie. Hoewel de licht / donker overgang te testen en een verhoogde plus maze worden allebei gebruikt voor de beoordeling van angst-achtig gedrag, zijn de resultaten niet altijd even consistent. Bijvoorbeeld, voorhersenen-specifieke calcineurine knockout muizen besteden een verminderde hoeveelheid tijd in het licht kamer in het licht / donker overgang test, maar een verhoogde hoeveelheid van de tijd in de open armen in de verhoogde plus maze (Miyakawa et al.., 2003) . Onze hypothese was dat ons licht / donker overgang te testen en een verhoogde plus maze test verschillende aspecten van angst-achtig gedrag, zoals helder-ruimte angst en open-ruimte angst-achtig gedrag te beoordelen. Om deze hypothese te testen, hebben we gebruik gemaakt van een grote dataset verzameld met behulp van dezelfde muizen in beide tests. In ons laboratorium, voeren we gedragstest batterijen die vele domeinen om te screenen voor de gedragsmatige betekenis van genen. De test batterij moet een aantal weken in beslag. Tijdens de testperiode, muis kooien gehouden op een rek in onze faciliteit. Als muizen zijn vervoerd naar het laboratorium van andere instellingen, zijn ze gewend aan het milieu van onze faciliteit voor minimaal 1 week. Na de gewenningsperiode, zijn muizen onderworpen aan een algemene gezondheid te controleren en neurologische screening (Miyakawa et al.., 2003), en na deze eenvoudige onderzoeken, muizen zijn onderworpen aan de licht / donker overgang test. De test wordt uitgevoerd in een geluidsdichte kamer experimenteel na 30 minuten van gewenning aan de experimentele ruimte, zoals getoond in de film. Wij hebben meer dan 60 stammen van genetisch gemanipuleerde mutante muizen met behulp van het protocol in de film en hebben een grote set van de ruwe gegevens voor meer dan 3.000 muizen (met inbegrip van wild-type en mutante muizen). Wij hebben factoranalyses om te profiteren van de grote set van de ruwe data. Inderdaad, we verschillende factoren gevonden van elke test (niet gepubliceerde gegevens), hoewel er enkele significante correlaties tussen de indices (ongepubliceerde gegevens) .. Deze gegevens zullen worden verstrekt als onderdeel van een openbare databank die we nu bouwen. In onze test batterij, zijn wild-type nestgenoten meestal gebruikt als een controle. Als een achtergrond stam, zijn C57BL/6J muizen gebruikt. We verzamelden de gegevens van C57BL/6J muizen gebruikt als een controle van de mutant muizen in de testbatterij. De indices verkregen uit C57BL/6J muizen in onze licht / donker overgang testen waren als volgt (n = 795 met een gemiddelde SEM), de afgelegde afstand: 846,5 8,88 cm in het licht kamer, 1.478,5 9,53 cm in de donkere kamer; duur van de tijd besteed aan : 215,8 1,85 s in het licht, 395,8 1,86 s in het donker; aantal overgangen tussen de compartimenten: 30,52 0,43; latency naar het licht kamer in te voeren: 64,94 2,40 s. Beweging van muizen rond de ingangen van de kamers wordt gedetecteerd door de camera en wordt geteld als de tijd doorgebracht in zowel CHambers. Vanwege dit, de som van de gemiddelde duur van de tijd doorgebracht in het licht en dat in het donker compartimenten groter was dan die van de gehele duur van de test (600 s). In ons protocol, is een muis voor het eerst geplaatst in de donkere kamer. Drie seconden na het plaatsen van de muis in de donkere kamer, de deur tussen de kamers wordt automatisch geopend en de muis kan vrij bewegen tussen de twee kamers. C57BL/6J muizen besteden minder tijd in het licht kamer dan in de donkere kamer (p &lt;0,0001, de duur als de tijd doorgebracht in het licht: 215.8 1.85 s, de duur van de tijd doorgebracht in het donker: 316.3 2.11 s [de tijd doorgebracht in het donker doet niet de eerste tijd in het donker voorafgaand aan het invoeren van de licht kamer voor de eerste keer], n = 795, gepaarde t-test). Dit geeft aan dat C57BL/6J muizen hebben de neiging om het licht kamer te vermijden, en dat de tijd doorgebracht in het licht is een goede index van angst-achtig gedrag. De resultaten van verschillende stammen van mutante muizen gemakkelijk worden vergeleken, omdat alle gegevens zijn verkregen met behulp van hetzelfde protocol. Voor het verkrijgen van fenotypering resultaten van een stam van mutante muizen die gemakkelijk kan worden gereproduceerd en vergeleken met gegevens van andere mutanten, dient de gedrags-testmethoden worden zo identiek mogelijk tussen laboratoria. Crabbe en zijn collega&#39;s testten de interactie tussen de muis gedrag en laboratorium-omgeving met behulp van exact dezelfde inteeltstammen en een null mutante stam. In hun studie, het apparaat, testprotocollen, en vele omgevingsvariabelen werden grondig gestandaardiseerd. Ondanks de standaardisatie, vonden zij systematische verschillen in gedrag tussen laboratoria, hoewel ze ook gedetecteerd stam verschillen in alle gedragingen (Crabbe et al.., 1999). Ze meldden dat oncontroleerbare variabelen en experimenten karakteriseren van mutanten kunnen de resultaten die zijn eigenzinnig om een ​​bepaald laboratorium opbrengst. De procedurele verschillen tussen laboratoria maken het moeilijk om te repliceren of de resultaten vergelijken tussen laboratoria. Hier presenteren we onze protocol voor de licht / donker overgang test als een film, zodat de details van het protocol kan worden aangetoond. Tot vaststelling van visuele documentatie van het protocol zal vergemakkelijken beter begrip van de details van de experimentele procedures, waardoor standaardisatie van de protocollen gebruikt in laboratoria en voor vergelijkingen van de gedrags-fenotypen van verschillende stammen van mutante muizen beoordeeld met behulp van deze test. Films van andere protocollen, zoals voor de verhoogde plus maze, open veld te testen, porsolt geforceerde zwemtest, angst conditionering, die we gebruiken in onze gedrags-testbatterij worden momenteel gemaakt voor publicatie als toekomstig video tijdschriftartikelen.

light/dark transition test for mice

Hoewel alle van de muis genoomsequenties zijn vastgesteld, weten we nog niet weten de functies van de meeste van deze genen. Gen-targeting technieken, kan echter worden gebruikt voor het verwijderen of te manipuleren een specifiek gen in muizen. De invloed van een bepaald gen op een bepaald gedrag kan dan worden bepaald door het uitvoeren van gedrags-analyses van de mutante muizen. Als een test voor gedragsverandering fenotypering van mutante muizen, de licht / donker overgang test is een van de meest gebruikte tests om angst-achtig gedrag te meten bij muizen. De test is gebaseerd op de natuurlijke afkeer van muizen om helder verlichte gebieden en op hun spontane verkennende gedrag in nieuwe omgevingen. De test is gevoelig voor anxiolytische medicamenteuze behandeling. Het apparaat bestaat uit een donkere kamer en een helder verlichte kamer. Muizen zijn vrij kunnen bewegen tussen de twee kamers. Het aantal vermeldingen in de lichte kamer en de duur van de tijd zijn er indices van helder-ruimte angst bij muizen. Voor het verkrijgen van fenotypering resultaten van een stam van mutante muizen die gemakkelijk kan worden gereproduceerd en vergeleken met die van andere mutanten, dient de gedrags-testmethoden worden zo identiek mogelijk tussen laboratoria. De procedurele verschillen die er tussen laboratoria, echter, maken het moeilijk om te repliceren of de resultaten vergelijken tussen laboratoria. Hier presenteren we onze protocol voor de licht / donker overgang test als een film, zodat de details van het protocol kan worden aangetoond. In ons laboratorium hebben we onderzocht meer dan 60 stammen van mutante muizen met behulp van het protocol in de film. Deze gegevens zullen worden verstrekt als onderdeel van een openbare databank die we nu bouwen. Visualisatie van het protocol zal vergemakkelijken begrip van de details van de gehele experimentele procedure, waardoor standaardisatie van de protocollen gebruikt in laboratoria en vergelijkingen van de gedrags-fenotypen van verschillende stammen van mutante muizen beoordeeld met behulp van deze test.

Watch this Scientific Journal Video about Light/dark Transition Test for Mice at JoVE.com

Light/dark Transition Test for Mice

Het licht / donker overgang test is een van de meest gebruikte tests om angst-achtig gedrag te meten bij muizen. Hier presenteren we een film die gedetailleerde procedures over hoe we het gedrag van de test toont.

Licht / donker Overgang test voor Muizen

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Elevated Plus Maze for Mice

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given gene on a specific behavior can be determined by behavioral analysis of mutant mice. If a target gene is expressed in the brain, behavioral phenotype of the mutant mice could elucidate the genetic mechanism of normal behaviors. The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior. The test is based on the natural aversion of mice for open and elevated areas, as well as on their natural spontaneous exploratory behavior in novel environments. The apparatus consists of open arms and closed arms, crossed in the middle perpendicularly to each other, and a center area. Mice are given access to all of the arms and are allowed to move freely between them. The number of entries into the open arms and the time spent in the open arms are used as indices of open space-induced anxiety in mice. Unfortunately, the procedural differences that exist between laboratories make it difficult to duplicate and compare results among laboratories. Here, we present a detailed movie demonstrating our protocol for the elevated plus maze test. In our laboratory, we have assessed more than 90 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. These data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.
Visualization of the protocol will promote better understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used in different laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test. 


The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie showing the detailed procedures for conducting the test.

Verhoogd Plus Maze voor muizen

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key symptoms, such as tremor, rigidity and bradikinesia, develop when about 3/4 of dopaminergic cells are lost in the substantia nigra, and fail to provide for the smooth, coordinated regulation of striatal motor circuits. Depression and hallucinations are common, and dementia eventually occurs in 20% of patients. At this time, there is no treatment to delay or stop the progression of PD. Rather, the medications currently available aim more towards the alleviation of these symptoms. New surgical strategies may reversibly switch on the functionally damaged circuits through the electrical stimulation of deep brain structures, but although deep brain stimulation is a major advance, it is not suitable for all patients. It remains therefore necessary to test new cell therapy approaches in preclinical models.
Selective neurotoxic disruption of dopaminergic pathways can be reproduced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tertahydropyridine) whereas depleting drugs and oxidative-damaging chemicals may also reproduce specific features of PD in rodents. Unlike MPTP, 6-OHDA lesions cause massive irreversible neuronal loss, and can be uni- or bilateral. The 6-OHDA lesion model is reliable, leads to robust motor deficits, and is the most widely used after 40 years of research in rats1. As interactions between grafted cells and host can now be studied more thoroughly in mice rather than in rats, the model has been transposed to mice2,3, where it has been recently characterized4.
In this video, we demonstrate how to lesion the left nigro-striatal pathway of anesthetized mice by slowly delivering 2.0 &mu;L of 6-OHDA through a stereotaxically inserted micro-syringe needle. The loss of dopaminergic input occurs within days, and the functional impairments can be monitored over post-operative weeks and months by rating animal rotations induced by dopaminergic agents5. Here, we show full-body contralateral rotations occurring 10 minutes after a single subcutaneous administration of apomorphine, measured one month after the lesion. Outcomes and drawbacks are discussed below.

Murine Model for Parkinson&#039;s Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson disease is caused by loss of dopaminergic innervation to the striatum, which can be experimentally induced by 6-OH-dopamine. We describe how to perform a stereotaxic lesion and to monitor apomorphine-induced rotational behavior in mice. This model is useful and reliable for testing new therapies for Parkinson disease.

Muismodel voor de ziekte van Parkinson: van 6-OH Dopamine Laesie naar Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

Een allel-specifieke genexpressie Assay aan de functionele basis van genetische associaties Test

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Lange-termijn Lethal toxiciteit Test met de Schaal- Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Blastomeer Explantaten om te testen voor mobiele Fate Commitment tijdens de embryonale ontwikkeling

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Test Monsters voor het optimaliseren van STORM superresolutietechnieken

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Detectie van alternatieve splicing Tijdens-mesenchymale transitie

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.