Name: light/dark transition test for mice
Uploaded: 2006-11-13T00:00:00
Duration: 10 min 35 s
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इस शोध के द्वारा समर्थित किया गया सहायता अनुदान में युवा वैज्ञानिकों (ए) (16,680,015 #), खोजपूर्ण शोध के लिए अनुदान में सहायता (16,653,065 #), प्राथमिकता वाले क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान सहायता (18,023,022 # # 18016012 और 18053015 से शिक्षा मंत्रालय, संस्कृति, खेल, विज्ञान, और प्रौद्योगिकी जापान में, अनुदान सहायता में अनुदान बायोमेडिकल अभिनव के राष्ट्रीय संस्थान (NIBIO), के स्वास्थ्य विज्ञान में मौलिक अध्ययन के संवर्धन से) Neuroinformatics जापान (NIJC) केंद्र, आरआईकेईएन से सहायता

<ol><li> संक्रमण / प्रकाश अंधेरे परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया उपकरण (21x42x25 सेमी) पिंजरे दरवाजे के साथ एक विभाजन (Ohara एंड कं, टोक्यो) के द्वारा बराबर आकार के दो वर्गों में विभाजित शामिल है. </li><li> चूहे विज्ञापन libitum भोजन और पानी के लिए उपयोग के साथ एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र (7:00 AM पर रोशनी) के साथ एक कमरे में तीन पिंजरे प्रति चार रखे जाते हैं. आदर्श रूप में, एक साथ दो नियंत्रण और दो म्यूटेंट रखे जाते हैं के रूप में जल्द ही के रूप में वे दूध छुड़ाने का वायु के समय genotyped हैं चूहों पुनः आयोजन करके. व्यवहार परीक्षण 9:00 के बीच किया जाता है AM और 6:00 सभी चूहों युक्त पिंजरों व्यवहार परीक्षण कमरे में 30 मिनट स्थानांतरित कर रहे हैं पहले परीक्षण से पहले शुरू होता है. </li><li> एक कक्ष चमकीले सफेद डायोड (लक्स 390) के द्वारा प्रबुद्ध है, जबकि अन्य कक्ष (लक्स 2) अंधेरा है. चूहे अंधेरे पक्ष में रखा जाता है और दरवाजा 3 स्वतः सेकंड खोला बाद माउस अवरक्त कैमरे द्वारा पता चला है. दरवाजा इतना प्रयोग किया जाता है कि चूहों प्रकाश चैम्बर तुरंत प्रवेश नहीं करते हैं उनके experimenter से बचने की प्रेरणा के साथ रिलीज के बाद, के बाद से प्रकाश कक्ष में प्रवेश करने के लिए विलंबता चिंता की तरह व्यवहार के एक सूचकांक के रूप में सेवा कर सकता है. </li><li> चूहे के लिए 10 मिनट के लिए खुले दरवाजे के साथ दो कोठरियों के बीच आसानी से ले जाने के लिए अनुमति दी जाती है है. व्यवहार डेटा (LD4 छवि) प्राप्त करने और विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया आवेदन सार्वजनिक डोमेन छवि जम्मू कार्यक्रम (मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान में byWayne Rasband विकसित और http://rsb.info.nih.gov/ij पर उपलब्ध पर आधारित है /) है, जो Tsuyoshi Miyakawa (O&#39;Hara एंड कं, टोक्यो, जापान के माध्यम से उपलब्ध है) के द्वारा संशोधित किया गया था. </li><li> दूरी कूच, प्रत्येक कक्ष में संक्रमण की कुल संख्या, कक्ष प्रत्येक में बिताए समय, और प्रकाश छवि LD4 प्रोग्राम द्वारा दर्ज chamberare दर्ज विलंबता. </li><li> प्रत्येक परीक्षण के बाद, सभी कक्षों सुपर hypochlorous पानी से साफ कर रहे हैं के लिए एक घ्राण cues के आधार पर पूर्वाग्रह को रोकने के. </li></ol>

<ol>
	<li>Austin, C. P., Aiba, A., Takao, K., Miyakawa, T., Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T., Crawley, J. N., Crawley, J. N., Crawley, J., Goodwin, F. K., Miyakawa, T., Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36, 921-924 (2004).</li></ol>

सभी प्रक्रियाओं पशु का प्रयोग करें और क्योटो विश्वविद्यालय की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया. Tsuyoshi Miyakawa बर्ड, जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी, Saitama, जापान के साथ जुड़ा हुआ है.

हालांकि माउस जीनोम अनुक्रम के सभी निर्धारित किया गया है, इन जीनों के अधिकांश के कार्य नहीं जाना जाता है. जीन लक्ष्यीकरण तकनीकों, तथापि, चूहों में एक विशेष जीन (; ऑस्टिन एट अल, 2004. Aiba एट अल, 2007) को हटाने या हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उत्परिवर्ती चूहों के व्यवहार विश्लेषण (; Takao एट अल, 2007 Takao और Miyakawa, 2006) द्वारा आयोजित एक विशिष्ट व्यवहार पर किसी जीन के प्रभाव तो निर्धारित किया जा सकता है. उत्परिवर्ती चूहों के व्यवहार phenotyping के लिए एक परीक्षण के रूप में, संक्रमण / प्रकाश अंधेरे परीक्षण एक सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल करने के लिए चूहों में व्यवहार (Crawley, 2000) की तरह चिंता को मापने के लिए परीक्षण के है. परीक्षण चूहों के प्राकृतिक चमकीले प्रबुद्ध क्षेत्रों के लिए घृणा और अपने उपन्यास के वातावरण में सहज खोजपूर्ण व्यवहार (Crawley, 1985) पर आधारित है. परीक्षण anxiolytic दवा इलाज (Crawley, 1985) के प्रति संवेदनशील है. तंत्र एक अंधेरे कक्ष और एक चमकीले प्रबुद्ध कक्ष के होते हैं. एक प्रतिबंधित खोलने, 3 सेमी उच्च, 5 सेमी चौड़ा द्वारा दो कक्षों को जोड़ता है. चूहे दो कोठरियों के बीच आसानी से ले जाने के लिए अनुमति दी जाती है है. उज्ज्वल चेंबर में प्रविष्टियों की संख्या और समय की अवधि के खर्च उज्ज्वल अंतरिक्ष चूहों में चिंता का सूचकांक के रूप में उपयोग किया जाता है. संक्रमण / प्रकाश अंधेरे परीक्षण मूल Crawley और सहयोगियों (Crawley और गुडविन, 1980) द्वारा विकसित किया गया था. उनके मूल संस्करण और हमारे परीक्षण के बीच दो मतभेद हैं. सबसे पहले, प्रकाश चैम्बर मूल संस्करण में अंधेरे कक्ष से बड़ा है, जबकि दो कक्षों का आकार परीक्षण के हमारे संस्करण में ही है. दूसरा, मूल संस्करण में, प्रकाश चैम्बर कोई छत नहीं थी और पारदर्शी प्रकाश कक्ष की दीवारों (Crawley और गुडविन, 1980) थे, जबकि हम प्रकाश कक्ष की छत और दीवारों के लिए अपारदर्शी सफेद प्लास्टिक का उपयोग करें. इन मतभेदों को, अर्थात् आकार और प्रकाश चैम्बर के खुलेपन, उज्ज्वल अंतरिक्ष चिंता के साथ - साथ पहचान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परीक्षण के मूल संस्करण में चिंता खुले अंतरिक्ष के लिए अनुमति देते हैं. हमारी प्रयोगशाला में, तथापि, खुले अंतरिक्ष चूहों में व्यवहार की तरह चिंता एक ऊंचा प्लस भूलभुलैया में परीक्षण किया है. दीवारों और छत अपारदर्शी, प्रकाश चैम्बर के आकार, और हमारे विशिष्ट / प्रकाश अंधेरे संक्रमण परीक्षण प्रोटोकॉल मूल संस्करण की तुलना में उज्ज्वल अंतरिक्ष चिंता का पता लगाने के लिए विशेष है. हालांकि संक्रमण / प्रकाश अंधेरे परीक्षण और ऊंचा भूलभुलैया प्लस दोनों तरह व्यवहार चिंता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है, परिणाम हमेशा अनुरूप नहीं हैं. उदाहरण के लिए, अग्रमस्तिष्क विशेष calcineurin पीटा चूहों संक्रमण / प्रकाश अंधेरे परीक्षण में प्रकाश के चैम्बर में समय की एक कम राशि खर्च करते हैं, लेकिन ऊंचा प्लस भूलभुलैया में खुले हाथों में समय की वृद्धि हुई राशि (Miyakawa एट अल, 2003) . हम धारणा है कि हमारे प्रकाश / अंधेरे संक्रमण परीक्षण और ऊंचा प्लस भूलभुलैया परीक्षण चिंता की तरह व्यवहार के विभिन्न पहलुओं का आकलन जैसे उज्ज्वल अंतरिक्ष चिंता और खुली जगह चिंता की तरह व्यवहार. इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हम एक बड़ा सेट दोनों परीक्षणों में एक ही चूहों का उपयोग कर एकत्र आंकड़ों का इस्तेमाल किया. हमारी प्रयोगशाला में, हम व्यवहार परीक्षण जीन के व्यवहार महत्व के लिए स्क्रीन करने के लिए कई डोमेन कवर बैटरी आचरण. परीक्षण बैटरी को पूरा करने के लिए कई हफ्तों की आवश्यकता है. परीक्षण अवधि के दौरान, माउस पिंजरों हमारे सुविधा में एक रैक पर रखा जाता है. यदि चूहों अन्य संस्थानों से हमारी प्रयोगशाला में ले जाया जाता है, वे कम से कम 1 सप्ताह के लिए हमारी सुविधा के पर्यावरण के लिए आदत कर रहे हैं. Habituation अवधि के बाद, चूहों एक सामान्य स्वास्थ्य जांच और स्क्रीनिंग neurologic (Miyakawa एट अल. 2003) के अधीन हैं, और इन सरल परीक्षाओं के बाद, चूहों संक्रमण / प्रकाश अंधेरे परीक्षण करने के लिए अधीन हैं. परीक्षण habituation की प्रयोगात्मक कमरे में 30 मिनट के बाद एक ध्वनि सबूत प्रयोगात्मक कमरे में आयोजित किया जाता है, के रूप में फिल्म में दिखाया गया है. हम अनुवांशिक इंजीनियर उत्परिवर्ती फिल्म में दिखाया गया है प्रोटोकॉल का उपयोग चूहों के 60 से अधिक उपभेदों का आकलन किया है और 3000 से अधिक चूहों (जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती चूहों सहित) के लिए कच्चे डेटा का एक बड़ा सेट है. हम कारक विश्लेषण का आयोजन करने के लिए कच्चे डेटा के बड़े सेट का लाभ ले लो. दरअसल, हम प्रत्येक परीक्षण (अप्रकाशित डेटा) से विभिन्न कारकों का पता चला, यद्यपि वहाँ सूचकांक (अप्रकाशित डेटा) के बीच कुछ महत्वपूर्ण सहसंबंध थे .. उन डेटा एक सार्वजनिक डेटाबेस है कि अब हम निर्माण कर रहे हैं के हिस्से के रूप में बताया जाएगा. हमारे परीक्षण बैटरी, जंगली प्रकार littermates के आम तौर पर एक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है. एक पृष्ठभूमि तनाव के रूप में, C57BL/6J चूहों आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है है. हम C57BL/6J परीक्षण बैटरी में उत्परिवर्ती चूहों के नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल चूहों के डेटा एकत्र. C57BL/6J हमारे संक्रमण / प्रकाश अंधेरे परीक्षण में चूहों से प्राप्त सूचकांक के रूप में इस प्रकार थे (n = 795; मतलब SEM), दूरी कूच: प्रकाश के चैम्बर में 846.5 8.88 सेमी 1478.5 अंधेरे कक्ष में 9.53 सेमी, समय की अवधि खर्च 215.8 प्रकाश में 1.85 है, अंधेरे में 395.8 1.86 एस; डिब्बों के बीच संक्रमण के संख्या: 30.52 .43, प्रकाश कक्ष में प्रवेश करने के लिए विलंबता: 64.94 2.40 एस कक्षों के लिए प्रवेश द्वार के आसपास चूहों के आंदोलन कैमरा से पता चला है और दोनों ग में बिताए समय के रूप में गिना हैhambers. इस वजह से प्रकाश में समय का मतलब अवधि की राशि खर्च और है कि अंधेरे डिब्बों में परीक्षण (600 s) की पूरी अवधि के तुलना में अधिक था. हमारे प्रोटोकॉल में, एक माउस पहले अंधेरे कक्ष में रखा गया है. अंधेरे कक्ष में माउस रखने के बाद तीन सेकंड कोठरियों के बीच दरवाजा स्वचालित रूप से खुलता है और माउस स्वतंत्र रूप से दो कोठरियों के बीच ले जा सकते हैं. 215.8 एस 1.85, अंधेरे में बिताए समय की अवधि: 316.3 2.11 एस [समय अंधेरे में खर्च करता है C57BL/6J चूहों प्रकाश के चैम्बर में अंधेरे कक्ष में की तुलना में कम समय (पी &lt;.0001, अवधि है अगर समय प्रकाश में खर्च खर्च प्रारंभिक समय पहले अंधेरे में खर्च के लिए पहली बार के लिए प्रकाश], n 795 = बनती टी) परीक्षा कक्ष में प्रवेश कर शामिल नहीं है. यह इंगित करता है कि C57BL/6J चूहों प्रकाश चैम्बर से बचने के प्रयास करते हैं, और समय प्रकाश में खर्च चिंता की तरह व्यवहार का एक अच्छा सूचकांक है कि. उत्परिवर्ती चूहों के विभिन्न प्रकारों से प्राप्त परिणामों को आसानी से तुलना कर रहे हैं क्योंकि सभी डेटा एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. उत्परिवर्ती चूहों की एक नस्ल है कि आसानी से और reproduced किया जा सकता है अन्य म्यूटेंट के डेटा के साथ तुलना की phenotyping परिणाम प्राप्त करने के लिए, व्यवहार परीक्षण तरीकों के रूप में प्रयोगशालाओं के बीच संभव के रूप में समान होना चाहिए. Crabbe और उनके सहयोगियों माउस व्यवहार और प्रयोगशाला वातावरण बिल्कुल ही सहज उपभेदों और एक अशक्त उत्परिवर्ती तनाव का उपयोग कर के बीच बातचीत का परीक्षण किया. उनके अध्ययन में, तंत्र, परीक्षण प्रोटोकॉल, और कई पर्यावरण चर कड़ाई से मानकीकृत थे. मानकीकरण के बावजूद, वे प्रयोगशालाओं भर में व्यवहार में व्यवस्थित अंतर पाया गया, हालांकि वे भी सभी व्यवहार (Crabbe एट अल., 1999) में तनाव मतभेदों का पता चला. उन्होंने बताया कि बेकाबू चर और प्रयोगों म्यूटेंट निस्र्पक के परिणाम उपज सकता है कि एक विशेष प्रयोगशाला के लिए विशेष स्वभाव हैं. प्रक्रियात्मक मतभेद है कि प्रयोगशालाओं के बीच मौजूद हैं यह मुश्किल को दोहराने या प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों की तुलना करते हैं. यहाँ, हम प्रकाश / अंधेरे तो एक फिल्म है कि प्रोटोकॉल का विवरण प्रदर्शन किया जा सकता है के रूप में संक्रमण के परीक्षण के लिए हमारे प्रोटोकॉल उपस्थित थे. प्रोटोकॉल के दृश्य प्रलेखन स्थापना प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के विवरण के बेहतर समझ की सुविधा प्रयोगशालाओं के पार और उत्परिवर्ती चूहों के विभिन्न प्रकारों का व्यवहार phenotypes की तुलना के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल के मानकीकरण के लिए अनुमति देता है इस परीक्षण का उपयोग का आकलन किया. अधिक ऊंचा भूलभुलैया, खुले मैदान परीक्षण, porsolt मजबूर तैरना परीक्षण, भय कंडीशनिंग, है कि हम हमारे व्यवहार परीक्षण बैटरी में प्रयोग के लिए जैसे अन्य प्रोटोकॉल, सिनेमा वर्तमान में भविष्य वीडियो पत्रिका लेख के रूप में प्रकाशन के लिए किए जा रहे हैं.

light/dark transition test for mice

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, however, can be used to delete or manipulate a specific gene in mice. The influence of a given gene on a specific behavior can then be determined by conducting behavioral analyses of the mutant mice. As a test for behavioral phenotyping of mutant mice, the light/dark transition test is one of the most widely used tests to measure anxiety-like behavior in mice. The test is based on the natural aversion of mice to brightly illuminated areas and on their spontaneous exploratory behavior in novel environments. The test is sensitive to anxiolytic drug treatment. The apparatus consists of a dark chamber and a brightly illuminated chamber. Mice are allowed to move freely between the two chambers. The number of entries into the bright chamber and the duration of time spent there are indices of bright-space anxiety in mice. To obtain phenotyping results of a strain of mutant mice that can be readily reproduced and compared with those of other mutants, the behavioral test methods should be as identical as possible between laboratories. The procedural differences that exist between laboratories, however, make it difficult to replicate or compare the results among laboratories. Here, we present our protocol for the light/dark transition test as a movie so that the details of the protocol can be demonstrated. In our laboratory, we have assessed more than 60 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. Those data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.

Visualization of the protocol will facilitate understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used across laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test.

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Light/dark Transition Test for Mice

संक्रमण / प्रकाश अंधेरे परीक्षण एक सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल करने के लिए चूहों में व्यवहार की तरह चिंता को मापने के लिए परीक्षण के है. यहाँ, हम एक फिल्म है कि कैसे हम परीक्षण आचरण पर विस्तृत प्रक्रिया से पता चलता है वर्तमान.

/ प्रकाश अंधेरे चूहे के लिए संक्रमण टेस्ट

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Research

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Biology

Elevated Plus Maze for Mice

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given gene on a specific behavior can be determined by behavioral analysis of mutant mice. If a target gene is expressed in the brain, behavioral phenotype of the mutant mice could elucidate the genetic mechanism of normal behaviors. The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior. The test is based on the natural aversion of mice for open and elevated areas, as well as on their natural spontaneous exploratory behavior in novel environments. The apparatus consists of open arms and closed arms, crossed in the middle perpendicularly to each other, and a center area. Mice are given access to all of the arms and are allowed to move freely between them. The number of entries into the open arms and the time spent in the open arms are used as indices of open space-induced anxiety in mice. Unfortunately, the procedural differences that exist between laboratories make it difficult to duplicate and compare results among laboratories. Here, we present a detailed movie demonstrating our protocol for the elevated plus maze test. In our laboratory, we have assessed more than 90 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. These data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.
Visualization of the protocol will promote better understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used in different laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test. 


The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie showing the detailed procedures for conducting the test.

चूहे के लिए ऊंचा प्लस भूलभुलैया

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key symptoms, such as tremor, rigidity and bradikinesia, develop when about 3/4 of dopaminergic cells are lost in the substantia nigra, and fail to provide for the smooth, coordinated regulation of striatal motor circuits. Depression and hallucinations are common, and dementia eventually occurs in 20% of patients. At this time, there is no treatment to delay or stop the progression of PD. Rather, the medications currently available aim more towards the alleviation of these symptoms. New surgical strategies may reversibly switch on the functionally damaged circuits through the electrical stimulation of deep brain structures, but although deep brain stimulation is a major advance, it is not suitable for all patients. It remains therefore necessary to test new cell therapy approaches in preclinical models.
Selective neurotoxic disruption of dopaminergic pathways can be reproduced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tertahydropyridine) whereas depleting drugs and oxidative-damaging chemicals may also reproduce specific features of PD in rodents. Unlike MPTP, 6-OHDA lesions cause massive irreversible neuronal loss, and can be uni- or bilateral. The 6-OHDA lesion model is reliable, leads to robust motor deficits, and is the most widely used after 40 years of research in rats1. As interactions between grafted cells and host can now be studied more thoroughly in mice rather than in rats, the model has been transposed to mice2,3, where it has been recently characterized4.
In this video, we demonstrate how to lesion the left nigro-striatal pathway of anesthetized mice by slowly delivering 2.0 &mu;L of 6-OHDA through a stereotaxically inserted micro-syringe needle. The loss of dopaminergic input occurs within days, and the functional impairments can be monitored over post-operative weeks and months by rating animal rotations induced by dopaminergic agents5. Here, we show full-body contralateral rotations occurring 10 minutes after a single subcutaneous administration of apomorphine, measured one month after the lesion. Outcomes and drawbacks are discussed below.

Murine Model for Parkinson&#039;s Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson disease is caused by loss of dopaminergic innervation to the striatum, which can be experimentally induced by 6-OH-dopamine. We describe how to perform a stereotaxic lesion and to monitor apomorphine-induced rotational behavior in mice. This model is useful and reliable for testing new therapies for Parkinson disease.

पार्किंसंस रोग के लिए murine मॉडल: 6-OH Dopamine घाव से व्यवहार टेस्ट

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

एक ऐल्लि विशिष्ट जीन एक्सप्रेशन आनुवंशिक संघों के कार्यात्मक आधार टेस्ट परख

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Crustacean साथ लंबी अवधि के घातक विषाक्तता टेस्ट Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

पारगम्यता संक्रमण ताकना खोलने की पृथक माउस Mitochondria हार्ट में मल्टी पैरामीटर मापन

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

ब्लास्टोमीयर explants सेल भाग्य प्रतिबद्धता के लिए भ्रूण विकास के दौरान टेस्ट

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mesenchymal संक्रमण के लिए प्रेरण और उपकला का विश्लेषण

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

अनुकूलन तूफान सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए परीक्षण के नमूने

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

उपकला-Mesenchymal संक्रमण के दौरान वैकल्पिक Splicing की जांच

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.