Name: light/dark transition test for mice
Uploaded: 2006-11-13T00:00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light/dark Transition Test for Mice at JoVE.com

Denna forskning har finansierats med bidrag-i-Stöd till unga forskare (A) (# 16.680.015), Grant-i-Stöd för undersökande forskning (# 16.653.065), Grant-i-Stöd för vetenskaplig forskning på prioriterade områden (# 18.023.022, # 18016012 och # 18053015) från ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik i Japan, Grant-i-Stöd från Främjande av grundläggande studier inom vårdvetenskap av National Institute of Biomedical Innovation (NIBIO), Grant-i- Stöd från Neuroinformatics Japan Center (NIJC), RIKEN

<ol><li> Den apparat som används för ljus / mörker övergång testet bestod av en bur (21x42x25 cm) uppdelad i två sektioner av samma storlek med en mellanvägg med dörr (Ohara &amp; Co, Tokyo). </li><li> Möss är inrymt 3:57 per bur i ett rum med en 12 tim ljus / mörker-cykel (lampor på kl 7:00) med ad lib tillgång till mat och vatten. Helst två kontroller och två mutanter inhyst tillsammans, genom att omorganisera de möss så snart de är genotypas vid tiden för avvänjning. Behavioral tester utförs från 9:00 till 6:00 Alla burarna innehåller möss överförs till beteendet testning rummet 30 minuter innan den första rättegången inleds. </li><li> Ett kammaren är klart upplyst av vita dioder (390 lux), medan den andra kammaren är mörkt (2 lux). Möss placeras i den mörka sidan och dörren öppnas automatiskt 3 sekunder efter att musen identifieras av värmekamera. Dörren används så att mössen inte kommer in i ljuset kammaren omedelbart efter släppet med deras motivation att fly från försöksledaren, eftersom latens att gå in i ljuset kammaren kan tjäna som ett index av ångest-liknande beteende. </li><li> Möss får röra sig fritt mellan de två kamrarna med dörren öppen i 10 min. Det program som används för att förvärva och analysera beteendemässiga data (Bild LD4) bygger på det offentliga området Image J-programmet (utvecklad byWayne Rasband vid National Institute of Mental Health och finns på http://rsb.info.nih.gov/ij /), som ändrades genom Tsuyoshi Miyakawa (tillgänglig via O&#39;Hara &amp; Co, Tokyo, Japan). </li><li> Sträckan i varje kammare, det totala antalet övergångar, tillbringade tiden i varje kammare, och latens in ljuset chamberare registreras av Image LD4 programmet. </li><li> Efter varje försök, alla kammare rengörs med super hypochlorous vatten för att förhindra en bias baserat på lukt ledtrådar. </li></ol>

<ol>
	<li>Austin, C. P., Aiba, A., Takao, K., Miyakawa, T., Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T., Crawley, J. N., Crawley, J. N., Crawley, J., Goodwin, F. K., Miyakawa, T., Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36, 921-924 (2004).</li></ol>

Alla förfaranden godkändes av Animal Användning och skötsel kommitté Kyoto University. Tsuyoshi Miyakawa förknippas med BIRD, Japan Science and Technology Agency, Saitama, Japan.

Även om alla de sekvenser musens arvsmassa har fastställts, är de funktioner de flesta av dessa gener inte känd. Gene inriktning tekniker, kan dock användas för att ta bort eller manipulera en specifik gen hos möss (Aiba et al, 2007;. Austin et al, 2004.). Inverkan av en viss gen på ett visst beteende kan sedan bestämmas genom att genomföra beteendemässiga analyser av den muterade möss (Takao och Miyakawa, 2006;. Takao et al, 2007). Som ett test för beteende-fenotypning av muterade möss, är den ljus / mörker övergång testa en av de mest använda testerna för att mäta ångest-liknande beteende hos möss (Crawley, 2000). Testet är baserat på naturliga motvilja hos möss till ljust upplysta områden och på deras spontana undersökande beteende i nya miljöer (Crawley, 1985). Testet är känsligt för ångestdämpande missbruksbehandling (Crawley, 1985). Apparaten består av en mörk kammare och ett starkt upplyst kammare. En begränsad öppning, 3 cm hög med 5 cm bred, förbinder de två kamrarna. Möss får röra sig fritt mellan de två kamrarna. Antalet inträden i ljusa kammaren och hur länge tid det används som index för ljus och rymd ångest hos möss. Det ljus / mörker övergången testet utvecklades ursprungligen av Crawley och kollegor (Crawley och Goodwin, 1980). Det finns två skillnader mellan den ursprungliga versionen och vårt test. För det första är ljus kammaren större än den mörka kammare i den ursprungliga versionen, medan storleken på de två kamrarna är densamma i vår version av testet. För det andra, i den ursprungliga versionen hade ljuset kammare inget tak och väggarna i ljuset kammaren var transparent (Crawley och Goodwin, 1980), medan vi använder ogenomskinlig vit plast för tak och väggar av ljuset kammaren. Dessa skillnader, nämligen stora och öppna ljuset kammare möjliggöra samtidig detektion av ljus och rymd ångest samt öppen yta ångest i den ursprungliga versionen av testet. I vårt laboratorium är dock öppen rymd ångest-liknande beteende hos möss testas i en förhöjd plus labyrint. Den ogenomskinliga väggar och tak, storlek ljuset kammaren och våra specifika ljus / mörker övergången testprotokoll är mer specialiserade för att upptäcka ljus och rymd ångest jämfört med den ursprungliga versionen. Även om ljus / mörker övergången test och förhöjda plus labyrint är både används för att bedöma ångest-liknande beteende, resultaten är inte alltid konsekvent. Till exempel framhjärnan-specifika kalcineurin knockoutmöss spendera en minskad mängd tid i ljuset kammare i ljus / mörker övergången test, men en ökad mängd tid i öppna armar i högt plus labyrint (Miyakawa et al., 2003) . Vi antar att vårt ljus / mörker övergången test och förhöjda plus labyrint tester utvärdera olika aspekter av ångest-liknande beteende, såsom ljus och rymd ångest och öppen rymd ångest-liknande beteende. För att testa denna hypotes använde vi en stor uppsättning data som samlas in med samma möss i båda testerna. I vårt laboratorium utför vi beteendemässiga testbatterier täcker många områden för att screena för beteendemässiga betydelsen av gener. Testet Batteriet behöver flera veckor att slutföra. Under testperioden, är mus burar hålls på galler i vår anläggning. Om möss transporteras till vårt laboratorium från andra institutioner, de är vana vid miljön i vår anläggning i minst en vecka. Efter tillvänjning perioden, möss utsätts för en allmän hälsokontroll och neurologiska screening (Miyakawa et al., 2003), och efter dessa enkla undersökningar, är möss utsätts för ljus / mörker övergången test. Testet utförs i ett ljudisolerat testrummet efter 30 min för tillvänjning till testrummet, som visas i filmen. Vi har utvärderat mer än 60 stammar av genetiskt modifierade muterade mössen använder protokollet som visas i filmen och har en stor uppsättning av rådata för mer än 3000 möss (inklusive vildtyp och muterade möss). Vi har genomfört faktoranalys för att dra nytta av den stora uppsättning av rådata. I själva verket upptäckte vi olika faktorer från varje test (opublicerade data), även om det fanns några signifikanta korrelationer mellan index (opublicerade data) .. Dessa uppgifter kommer att rapporteras som en del av en offentlig databas som vi nu bygger. I vårt test batteri, är vildtyp kullsyskon vanligtvis används som en kontroll. Som en bakgrund stam, är C57BL/6J möss används ofta. Vi samlade in data för C57BL/6J möss används som en kontroll av muterade mössen i testet batteriet. Indexen från C57BL/6J möss i våra ljus / mörker övergången testet var följande (n = 795, medelvärde SEM), tillryggalagd sträcka: 846,5 8,88 cm i ljuset kammaren, 1478,5 9,53 cm i den mörka kammare, varaktighet tid : 215,8 1,85 s i ljuset, 395,8 1,86 s i mörkret, antal övergångar mellan fack: 30,52 0,43; latens att gå in i ljuset kammaren: 64,94 2,40 s. Förflyttning av möss runt ingångarna till kamrarna upptäcks av kameran och räknas som tiden i både Chambers. På grund av detta spenderade summan av de genomsnittliga tiden för tid i ljuset och att i mörka utrymmen som var större än hela den tid som testet (600 s). I våra protokoll är en mus först släpptes ut i mörkret kammaren. Tre sekunder efter att placera musen i den mörka kammaren, öppnar dörren mellan kamrarna automatiskt och musen kan röra sig fritt mellan de två kamrarna. C57BL/6J möss spendera mindre tid i ljuset kammaren än i den mörka kammaren (p &lt;0,0001, tid om tiden i ljus: 215,8 1,85 s, längd tiden i mörkret: 316,3 2,11 s [tiden i mörkret inte omfattar inte den första tiden i mörkret före inträde ljuset kammare för första gången], n = 795, parade t-test). Detta tyder på att C57BL/6J möss tenderar att undvika ljus kammare, och att den tid i ljuset är ett bra index för ångest-liknande beteende. De resultat som erhålls från olika stammar av muterade möss är lätt att jämföra, eftersom alla data som erhålls genom att använda samma protokoll. För att få fenotypning resultaten av en stam av muterade möss som lätt kan reproduceras och jämföras med data från andra mutanter bör beteendemässiga testmetoder vara så identiska som möjligt mellan laboratorier. Crabbe och kollegor testade samspelet mellan mus beteende och laboratoriemiljö med hjälp av exakt samma inavlade stammar och en null mutant stam. I deras studie var apparater, testprotokoll, och många miljövariabler rigoröst standardiserade. Trots standardisering, fann de systematiska skillnader i beteende mellan laboratorier, även om de också upptäckt stam skillnader i alla beteenden (Crabbe et al., 1999). De rapporterade att okontrollerbara variabler och experiment karakteriserar mutanter kan ge resultat som är idiosynkratiska till ett visst laboratorium. De processuella skillnader som finns mellan laboratorier gör det svårt att replikera eller jämföra resultaten mellan laboratorier. Här presenterar vi våra protokoll för ljus / mörker övergången testet som en film så att uppgifter i protokollet kan påvisas. Etablera visuell dokumentation av protokollet kommer att underlätta bättre förståelse för detaljerna i experimentella förfaranden som medger en standardisering av de protokoll som används över hela laboratorier och för jämförelser av beteendemässiga fenotyper av olika stammar av muterade möss utvärderas med hjälp detta test. Filmer av andra protokoll, exempelvis för förhöjt plus labyrinten, öppet fält test porsolt tvingas simma testa, rädsla konditionering, som vi använder i vårt beteende testbatteri för närvarande görs för publicering som framtida artiklar video dagbok.

light/dark transition test for mice

Även om alla de sekvenser musens arvsmassa har fastställts, vi ännu inte vet de funktioner som de flesta av dessa gener. Gene inriktning tekniker, kan dock användas för att ta bort eller manipulera en specifik gen hos möss. Inverkan av en viss gen på ett visst beteende kan sedan bestämmas genom att genomföra beteendemässiga analyser av den muterade möss. Som ett test för beteende-fenotypning av muterade möss, är den ljus / mörker övergång testa en av de mest använda testerna för att mäta ångest-liknande beteende hos möss. Testet är baserat på naturliga motvilja hos möss till ljust upplysta områden och på deras spontana undersökande beteende i nya miljöer. Testet är känsligt för ångestdämpande läkemedelsbehandling. Apparaten består av en mörk kammare och ett starkt upplyst kammare. Möss får röra sig fritt mellan de två kamrarna. Antalet inträden i ljusa kammaren och hur länge tid finns indikationer på ljusa rymd ångest hos möss. För att få fenotypning resultaten av en stam av muterade möss som lätt kan reproduceras och jämföras med andra mutanter, bör beteendemässiga testmetoder vara så identiska som möjligt mellan laboratorier. De processuella skillnader som finns mellan laboratorier dock göra det svårt att replikera eller jämföra resultaten mellan laboratorier. Här presenterar vi våra protokoll för ljus / mörker övergången testet som en film så att uppgifter i protokollet kan påvisas. I vårt laboratorium har vi bedömt mer än 60 stammar av muterade möss använder protokollet som visas i filmen. Dessa uppgifter kommer att rapporteras som en del av en offentlig databas som vi nu bygger. Visualisering av protokollet kommer att underlätta förståelsen av detaljerna i hela experimentella förfarande, vilket möjliggör standardisering av de protokoll som används över laboratorier och jämförelser av de beteendemässiga fenotyper av olika stammar av muterade möss utvärderas med hjälp detta test.

Watch this Scientific Journal Video about Light/dark Transition Test for Mice at JoVE.com

Light/dark Transition Test for Mice

Den ljust / mörkt övergången test är en av de mest använda testerna för att mäta ångest-liknande beteende hos möss. Här presenterar vi en film som visar detaljerade förfaranden för hur vi genomför testet.

Ljus / mörk Transition Test för möss

Although all of the mouse genome sequences have been determined, we do not yet know the functions of most of these genes. Gene-targeting techniques, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Elevated Plus Maze for Mice

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given gene on a specific behavior can be determined by behavioral analysis of mutant mice. If a target gene is expressed in the brain, behavioral phenotype of the mutant mice could elucidate the genetic mechanism of normal behaviors. The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior. The test is based on the natural aversion of mice for open and elevated areas, as well as on their natural spontaneous exploratory behavior in novel environments. The apparatus consists of open arms and closed arms, crossed in the middle perpendicularly to each other, and a center area. Mice are given access to all of the arms and are allowed to move freely between them. The number of entries into the open arms and the time spent in the open arms are used as indices of open space-induced anxiety in mice. Unfortunately, the procedural differences that exist between laboratories make it difficult to duplicate and compare results among laboratories. Here, we present a detailed movie demonstrating our protocol for the elevated plus maze test. In our laboratory, we have assessed more than 90 strains of mutant mice using the protocol shown in the movie. These data will be disclosed as a part of a public database that we are now constructing.
Visualization of the protocol will promote better understanding of the details of the entire experimental procedure, allowing for standardization of the protocols used in different laboratories and comparisons of the behavioral phenotypes of various strains of mutant mice assessed using this test. 


The elevated plus maze test is one of the most widely used tests for measuring anxiety-like behavior in mice. Here, we present a movie showing the detailed procedures for conducting the test.

Förhöjda Plus Maze för möss

Although the mouse genome is now completely sequenced, the functions of most of the genes expressed in the brain are not known. The influence of a given ...

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key symptoms, such as tremor, rigidity and bradikinesia, develop when about 3/4 of dopaminergic cells are lost in the substantia nigra, and fail to provide for the smooth, coordinated regulation of striatal motor circuits. Depression and hallucinations are common, and dementia eventually occurs in 20% of patients. At this time, there is no treatment to delay or stop the progression of PD. Rather, the medications currently available aim more towards the alleviation of these symptoms. New surgical strategies may reversibly switch on the functionally damaged circuits through the electrical stimulation of deep brain structures, but although deep brain stimulation is a major advance, it is not suitable for all patients. It remains therefore necessary to test new cell therapy approaches in preclinical models.
Selective neurotoxic disruption of dopaminergic pathways can be reproduced by injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tertahydropyridine) whereas depleting drugs and oxidative-damaging chemicals may also reproduce specific features of PD in rodents. Unlike MPTP, 6-OHDA lesions cause massive irreversible neuronal loss, and can be uni- or bilateral. The 6-OHDA lesion model is reliable, leads to robust motor deficits, and is the most widely used after 40 years of research in rats1. As interactions between grafted cells and host can now be studied more thoroughly in mice rather than in rats, the model has been transposed to mice2,3, where it has been recently characterized4.
In this video, we demonstrate how to lesion the left nigro-striatal pathway of anesthetized mice by slowly delivering 2.0 &mu;L of 6-OHDA through a stereotaxically inserted micro-syringe needle. The loss of dopaminergic input occurs within days, and the functional impairments can be monitored over post-operative weeks and months by rating animal rotations induced by dopaminergic agents5. Here, we show full-body contralateral rotations occurring 10 minutes after a single subcutaneous administration of apomorphine, measured one month after the lesion. Outcomes and drawbacks are discussed below.

Murine Model for Parkinson&#039;s Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Parkinson disease is caused by loss of dopaminergic innervation to the striatum, which can be experimentally induced by 6-OH-dopamine. We describe how to perform a stereotaxic lesion and to monitor apomorphine-induced rotational behavior in mice. This model is useful and reliable for testing new therapies for Parkinson disease.

Murina Modell för Parkinsons sjukdom: från 6-OH Dopamin skada som Behavioral Test

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

An Allele-specific Gene Expression Assay to Test the Functional Basis of Genetic Associations

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been understood at molecular level. One of the mechanisms mediating the effect of DNA variants on phenotypes is gene expression, which has been shown to be particularly relevant for complex traits1.
This method tests in a cellular context the effect of specific DNA sequences on gene expression. The principle is to measure the relative abundance of transcripts arising from the two alleles of a gene, analysing cells which carry one copy of the DNA sequences associated with disease (the risk variants)2,3. Therefore, the cells used for this method should meet two fundamental genotypic requirements: they have to be heterozygous both for DNA risk variants and for DNA markers, typically coding polymorphisms, which can distinguish transcripts based on their chromosomal origin (Figure 1). DNA risk variants and DNA markers do not need to have the same allele frequency but the phase (haplotypic) relationship of the genetic markers needs to be understood. It is also important to choose cell types which express the gene of interest. This protocol refers specifically to the procedure adopted to extract nucleic acids from fibroblasts but the method is equally applicable to other cells types including primary cells.
DNA and RNA are extracted from the selected cell lines and cDNA is generated. DNA and cDNA are analysed with a primer extension assay, designed to target the coding DNA markers4. The primer extension assay is carried out using the MassARRAY (Sequenom)5 platform according to the manufacturer's specifications. Primer extension products are then analysed by matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS). Because the selected markers are heterozygous they will generate two peaks on the MS profiles. The area of each peak is proportional to the transcript abundance and can be measured with a function of the MassARRAY Typer software to generate an allelic ratio (allele 1: allele 2) calculation. The allelic ratio obtained for cDNA is normalized using that measured from genomic DNA, where the allelic ratio is expected to be 1:1 to correct for technical artifacts. Markers with a normalised allelic ratio significantly different to 1 indicate that the amount of transcript generated from the two chromosomes in the same cell is different, suggesting that the DNA variants associated with the phenotype have an effect on gene expression. Experimental controls should be used to confirm the results.

Genetic associations often remain unexplained at a functional level. This method aims to assess the effect of phenotype-associated genetic markers on gene expression by analyzing cells heterozygous for transcribed SNPs. The technology allows accurate measurement by MALDI-TOF mass spectrometry to quantify allele-specific primer extension products.

En allel-specifika Gene Expression analys för Testa funktionell grund av genetiska samband

The number of significant genetic associations with common complex traits is constantly increasing. However, most of these associations have not been ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Långsiktig Dödligt toxicitetstest med Crustacean Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

Flera parametrar Mätning av permeabiliteten Transition poröppning i isolerade mus hjärta mitokondrier

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Blastomer Explantat att testa Cell Fate engagemang under embryonal utveckling

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion och Analys av Epithelial till mesenkymala övergång

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

Test Prover för Optimera STORM Super-resolution Mikroskopi

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

Upptäckt av alternativ splits Under Epithelial-Mesenkymala Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Intravenous Injections in Neonatal Mice

Intravenous injection is a clinically applicable manner to deliver therapeutics. For adult rodents and larger animals, intravenous injections are technically feasible and routine. However, some mouse models can have early onset of disease with a rapid progression that makes administration of potential therapies difficult. The temporal (or facial) vein is just anterior to the ear bud in mice and is clearly visible for the first two days after birth on either side of the head using a dissecting microscope. During this window, the temporal vein can be injected with volumes up to 50 &#956;l. The injection is safe and well tolerated by both the pups and the dams. A typical injection procedure is completed within 1-2 min, after which the pup is returned to the home cage. By the third postnatal day the vein is difficult to visualize and the injection procedure becomes technically unreliable. This technique has been used for delivery of adeno-associated virus (AAV) vectors, which in turn can provide almost body-wide, stable transgene expression for the life of the animal depending on the viral serotype chosen.

Animal models of pediatric disease can experience early onset and aggressive disease progression. Clinically relevant therapy delivery to young mouse models can be technically difficult. This protocol describes a non-invasive intravenous injection method for newborn mice within the first two postnatal days of life.