资料来源：佩尔切特·蒂鲍特^1，2，3，穆尼尔·西尔万^1，2，3，苏菲·诺沃^4，雷切尔·戈卢布^1，2，3
1法国巴黎巴斯德研究所免疫学系淋巴病系
² INSERM U1223， 巴黎， 法国
³巴黎迪德罗大学，索邦巴黎城，大提琴巴斯德，巴黎，法国
⁴流式细胞测定，细胞学和生物标志物 UtechS，转化科学中心，巴斯德研究所，法国巴黎

免疫系统的整体功能是保护身体免受传染性生物和其他入侵者的攻击。白血球，或白细胞，是免疫系统的关键角色。感染后，它们被激活并启动免疫反应。白细胞可以分为不同的亚群（例如，骨髓细胞、淋巴细胞、树突状细胞），根据不同的参数，可以是生物、物理和/或功能（例如，大小、粒度和分泌）。描述白细胞的一个方法是通过其表面蛋白，主要是受体。每个白细胞群表示受体（例如细胞毒性、活化、迁移受体）的特定组合，这些受体可以定义种群中的子集。由于免疫系统包含广泛的细胞群，因此必须描述它们，以破译它们参与免疫反应。

流式细胞学（FC或FCM）是一种广泛使用的方法，用于分析细胞表面和细胞内分子的表达，在异质细胞混合物中描述和定义不同的细胞类型。流式细胞计由三个主要子系统组成：流体、光学和电子。流体系统将细胞在溪流中传输，以便它们逐一在激光前通过。光学系统由光源（激光器）照明粒子、光学滤光片将产生的光和荧光信号定向到适当的探测器。最后，电子系统将检测到的光信号转换成计算机可以处理的电子信号。当单个细胞在激光束前经过时，它会散射光。光束前面的探测器测量正向散射 （FS），侧测量侧散射 （SC） 的多个探测器测量。FS 与细胞大小相关，SC 与细胞粒度成正比。通过这种方式，通常可以仅根据细胞大小和粒度的差异来区分细胞群。

除了分析细胞的大小、形状和复杂性外，流式细胞仪还广泛用于检测细胞表面受体的表达（1）。这是通过使用含氟铬标记的单克隆抗体，结合已知的细胞特异性受体来实现。在激发时，这些结合的氟铬会发出一种特定波长的光，称为发射波长，可以检测并评分。荧光测量提供有关含氟铬标记细胞表面受体的定量和定性数据。血液学家首先使用FC对免疫细胞群进行治疗随访（2）。现在，它用于广泛的应用，如免疫分体、细胞活力、基因表达、细胞计数和GFP分析。

FACS（荧光活化细胞分拣机）是一种专门类型的流式细胞测定法，它使用荧光标记将细胞群分为亚群。与传统的流式细胞仪一样，首先收集FS、SC和荧光数据。然后，机器施加电荷（负或正），静电偏转系统（电磁铁）便于将含有电池的带电液滴收集到适当的管中。

图1：FACS的原理图表示形式。样品 （1） 在 FACS （2） 中吸进，并在激光 （3） 前面通过。细胞荧光由荧光检测器（4）检测。最后，细胞被整合到液滴中，感兴趣的细胞被偏转板（5）偏转，并收集在收集管（6）中。其余的细胞进入垃圾箱 （7）。请点击此处查看此图的较大版本。

FACS 的排序方面具有许多优点。许多测试可以帮助了解特定细胞在免疫系统中的作用，例如分析基因表达，如RT-qPCR、细胞周期或细胞因子分泌。然而，细胞应经过上游纯化，以获得明确和具体的结果。在这里，FACS有用，所需的细胞可以分类与高纯度，产生高度可靠和可重复的结果。FACS还可用于根据核或其他细胞内染色和表面受体的存在、缺失和密度对细胞进行排序。FACS现在是一种标准技术，用于纯化细胞亚群，能够同时对四个种群进行分类。

本实验室练习演示如何分离脾白细胞，然后如何使用 FACS 从脾白细胞混合物中具体分类 B 淋巴细胞。