Source: Perchet Thibaut^1,2,3, Meunier Sylvain^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
1 Unité de lymphopoiesis, Département d'immunologie, Institut Pasteur, Paris, France
² INSERM U1223, Paris, France
³ Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, France
⁴ Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Institut Pasteur, Paris, France

La fonction globale du système immunitaire est de défendre le corps contre les organismes infectieux et autres envahisseurs. Les globules blancs, ou leucocytes, sont les principaux acteurs du système immunitaire. Lors de l'infection, ils sont activés et déclenchent une réponse immunitaire. Les leucocytes peuvent être divisés en diverses sous-populations (p. ex. cellules myéloïdes, lymphocytes, cellules dendritiques) en fonction de différents paramètres qui peuvent être biologiques, physiques et/ou fonctionnels (p. ex. taille, granularité et sécrétion). Une façon de caractériser les leucocytes est à travers leurs protéines de surface, qui sont principalement des récepteurs. Chaque population de leucocytes exprime une combinaison spécifique de récepteurs (p. ex. récepteurs cytotoxiques, activants, récepteurs de migration) qui peuvent définir des sous-ensembles entre les populations. Comme le système immunitaire englobe un large éventail de populations cellulaires, il est essentiel de les caractériser pour déchiffrer leur participation à la réponse immunitaire.

La cytométrie de flux (FC ou FCM) est une méthode largement utilisée pour analyser l'expression de la surface cellulaire et des molécules intracellulaires, caractérisant et définissant différents types de cellules dans un mélange hétérogène de cellules. Les cytomètres de débit sont composés de trois sous-systèmes principaux : la fluidique, l'optique et l'électronique. Le système fluidique transporte les cellules dans un flux de telle sorte qu'elles passent devant un laser une par une. Le système optique se compose de sources lumineuses (lasers) pour éclairer les particules, de filtres optiques pour diriger la lumière résultante et de signaux fluorescents vers des détecteurs appropriés. Enfin, le système électronique convertit les signaux lumineux détectés en signaux électroniques qui peuvent être traités par l'ordinateur. Comme une cellule individuelle passe devant le faisceau laser, il disperse la lumière. Un détecteur devant le faisceau mesure la diffusion vers l'avant (FS) et plusieurs détecteurs sur le côté mesurent la diffusion latérale (SC). Le FS est en corrélation avec la taille des cellules et le SC est proportionnel à la granularité des cellules. De cette manière, les populations cellulaires peuvent souvent être distinguées en fonction des différences dans leur taille et leur granularité seulement.

En plus d'analyser la taille, la forme et la complexité d'une cellule, la cytométrie du débit est largement utilisée pour détecter l'expression des récepteurs de surface cellulaire (1). Ceci est accompli en utilisant des anticorps monoclonaux fluorochrome-étiquetés qui se lient aux récepteurs cellulaires-spécifiques connus. Lors de l'excitation, ces fluorochromes liés émettent une lumière de longueur d'onde spécifique, appelée longueur d'onde d'émission, qui peut être détectée et notée. Les mesures de fluorescence fournissent des données quantitatives et qualitatives sur les récepteurs de surface cellulaire étiquetés fluorochrome. Les hématologues ont été les premiers à utiliser FC pour le suivi thérapeutique des populations de cellules immunitaires (2). Maintenant, il est employé pour un large éventail d'applications telles que l'immunophénotypage, la viabilité de cellules, l'expression de gène, le comptage de cellules, et l'analyse de GFP.

LE FACS (Fluorescent Activated Cell Sorter) est un type spécialisé de cytométrie d'écoulement, qui trie une population de cellules en sous-population à l'aide d'un étiquetage fluorescent. Tout comme la cytométrie de flux classique, les premières données FS, SC et fluorescentes sont collectées. Ensuite, la machine applique une charge (négative ou positive) et un système de déviation électrostatique (électroaimants) facilite la collecte des gouttelettes chargées contenant des cellules dans des tubes appropriés.

Figure 1 : Représentation schématique du FACS. L'échantillon (1) est aspiré dans le FACS (2) et passé devant le laser (3). La fluorescence cellulaire est détectere par les détecteurs de fluorescence (4). Enfin, les cellules sont incorporées dans des gouttelettes et les cellules d'intérêt sont déviées par des plaques de déviation (5) et collectées dans un tube de collecte (6). Les cellules restantes vont à la poubelle (7). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

L'aspect tri du FACS présente de nombreux avantages. De nombreux tests peuvent aider à comprendre le rôle de cellules spécifiques dans le système immunitaire, telles que les analyses de l'expression des gènes comme RT-qPCR, cycle cellulaire, ou la sécrétion de cytokine. Cependant, les cellules doivent être purifiées en amont pour obtenir des résultats clairs et spécifiques. Ici, FACS est utile et les cellules désirées peuvent être triées avec une grande pureté, donnant des résultats très fiables et reproductibles. Les FACS peuvent également être utilisés pour trier les cellules en fonction de la coloration nucléaire ou d'autres taches intracellulaires et en fonction de la présence, de l'absence et de la densité des récepteurs de surface. FACS est maintenant une technique standard pour la purification des sous-populations de cellules et a la capacité de trier jusqu'à quatre populations simultanément.

Cet exercice de laboratoire démontre comment isoler les leucocytes spléniques et ensuite comment trier spécifiquement les cellules lymphoïdes B du mélange splénique de cellules de leucocyte utilisant FACS.