Quelle: Perchet Thibaut^1,2,3, Meunier Sylvain^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
1 Einheit für Lymphopoiese, Institut für Immunologie, Pasteur Institute, Paris, Frankreich
² INSERM U1223, Paris, Frankreich
³ Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, Frankreich
⁴ Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, Frankreich

Die allgemeine Funktion des Immunsystems besteht darin, den Körper gegen infektiöse Organismen und andere Eindringlinge zu verteidigen. Weiße Blutkörperchen, oder Leukozyten, sind die Wichtigsten Akteure des Immunsystems. Bei einer Infektion werden sie aktiviert und initiieren eine Immunantwort. Leukozyten können in verschiedene Subpopulationen (z. B. myeloische Zellen, Lymphozyten, dendritische Zellen) unterteilt werden, basierend auf verschiedenen Parametern, die biologisch, physisch und/oder funktionell sein können (z. B. Größe, Granularität und Sekretion). Eine Möglichkeit, Leukozyten zu charakterisieren, ist durch ihre Oberflächenproteine, die hauptsächlich Rezeptoren sind. Jede Leukozytenpopulation drückt eine spezifische Kombination von Rezeptoren (z. B. zytotoxische, aktivierende, Migrationsrezeptoren) aus, die Teilmengen unter den Populationen definieren können. Da das Immunsystem eine breite Palette von Zellpopulationen umfasst, ist es wichtig, sie zu charakterisieren, um ihre Teilnahme an der Immunantwort zu entschlüsseln.

Die Durchflusszytometrie (FC oder FCM) ist eine weit verbreitete Methode zur Analyse der Expression von Zelloberflächen und intrazellulären Molekülen, die verschiedene Zelltypen in einer heterogenen Zellmischung charakterisiert und definiert. Durchflusszytometer bestehen aus drei Hauptsubsystemen: Fluidik, Optik und Elektronik. Das Fluidiksystem transportiert die Zellen in einem Strom so, dass sie nacheinander vor einem Laser passieren. Das Optiksystem besteht aus Lichtquellen (Lasern) zur Beleuchtung der Partikel, optischen Filtern zur Steuerung des resultierenden Lichts und Fluoreszenzsignalen an geeignete Detektoren. Schließlich wandelt das Elektroniksystem die erfassten Lichtsignale in elektronische Signale um, die vom Computer verarbeitet werden können. Wenn eine einzelne Zelle vor dem Laserstrahl verläuft, streut sie Licht. Ein Detektor vor dem Strahl misst die Vorwärtsstreuung (FS) und mehrere Detektoren zur Seitenstreuung (SC). Der FS korreliert mit der Zellgröße und SC ist proportional zur Granularität der Zellen. Auf diese Weise können Zellpopulationen oft allein aufgrund von Unterschieden in ihrer Größe und Granularität unterschieden werden.

Neben der Analyse der Größe, Form und Komplexität einer Zelle wird die Durchflusszytometrie häufig zur Erkennung der Expression von Zelloberflächenrezeptoren verwendet (1). Dies wird durch die Verwendung von fluorchrom-markierten monoklonalen Antikörpern erreicht, die an bekannte zellspezifische Rezeptoren binden. Bei Anregung emittieren diese gebundenen Fluorchrome ein Licht von spezifischer Wellenlänge, genannt Emissionswellenlänge, das erkannt und bewertet werden kann. Fluoreszenzmessungen liefern quantitative und qualitative Daten über fluorchromemarkierte Zelloberflächenrezeptoren. Hämatologen nutzten FC als erste für die therapeutische Nachbeobachtung von Immunzellpopulationen (2). Jetzt wird es für eine Vielzahl von Anwendungen wie Immunophenotypisierung, Zelllebensfähigkeit, Genexpression, Zellzählung und GFP-Analyse verwendet.

FACS (Fluorescent Activated Cell Sorter) ist eine spezialisierte Art der Durchflusszytometrie, die eine Population von Zellen mithilfe der fluoreszierenden Kennzeichnung in Subpopulation sortiert. Genau wie bei der konventionellen Durchflusszytometrie werden erste FS-, SC- und Fluoreszenzdaten gesammelt. Dann wendet die Maschine eine Ladung (negativ oder positiv) an und ein elektrostatisches Ablenksystem (Elektromagnete) erleichtert die Entnahme geladener Tröpfchen, die Zellen in geeigneten Röhren enthalten.

Abbildung 1: Schematische Darstellung von FACS. Probe (1) wird im FACS (2) angesaugt und vor dem Laser (3) übergeben. Die Zellfluoreszenz wird von Fluoreszenzdetektoren wahrgenommen (4). Schließlich werden die Zellen in Tröpfchen eingearbeitet und die von Interesse sindden Zellen durch Umlenkplatten (5) abgelenkt und in einem Sammelrohr (6) gesammelt. Die restlichen Zellen gehen in den Papierkorb (7). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Der Sortieraspekt des FACS bietet viele Vorteile. Viele Tests können helfen, die Rolle bestimmter Zellen im Immunsystem zu verstehen, wie z. B. Analysen der Genexpression wie RT-qPCR, Zellzyklus oder Zytokinsekretion. Allerdings sollten Zellen vorgelagert gereinigt werden, um klare und spezifische Ergebnisse zu erhalten. Hier kommt FACS nützlich und die gewünschten Zellen können mit großer Reinheit sortiert werden, was sehr zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse liefert. FACS kann auch verwendet werden, um Zellen basierend auf nuklearen oder anderen intrazellulären Färbung und entsprechend der Anwesenheit, Abwesenheit, und Dichte der Oberflächenrezeptoren zu sortieren. FACS ist jetzt eine Standardtechnik für die Reinigung von Subpopulationen von Zellen und hat die Fähigkeit, bis zu vier Populationen gleichzeitig zu sortieren.

Diese Übungseinheit im Labor zeigt, wie man milden Leukozyten isoliert und dann mit FACS gezielt B-Lymphzellen aus der Milz-Leukozyten-Zellmischung sortiert.