מקור: פרצ'ט^{תיבו 1,2,3}, מוניר^{סילבן 1,2,3}, סופי נובאלט⁴, רחל גולוב^{1,2,3
יחידה אחת} ללימפופוליס, המחלקה לאימונולוגיה, מכון פסטר, פריז, צרפת
² INSERM U1223, פריז, צרפת
³ 100é Paris Diderot, סורבון פריז סיטה, צ'רול פסטר, פריז, צרפת
^{4 פלטפרום} ציטומטריה זרימה, ציטומטריה וסמנים ביולוגיים UtechS, המרכז למדע תרגום, מכון פסטר, פריז, צרפת

הפונקציה הכללית של המערכת החיסונית היא להגן על הגוף מפני אורגניזמים זיהומיים ופולשים אחרים. תאי דם לבנים, או לויקוציטים, הם שחקני המפתח של מערכת החיסון. לאחר זיהום, הם מופעלים וליזום תגובה חיסונית. ניתן לחלק לויקוציטים לתת-אוכלוסיות שונות (למשל, תאים מיאלואידיים, לימפוציטים, תאים דנדריטיים) בהתבסס על פרמטרים שונים שיכולים להיות ביולוגיים, פיזיים ו/או פונקציונליים (למשל, גודל, פירוט והפרשה). דרך אחת לאפיין לויקוציטים היא באמצעות חלבוני השטח שלהם, שהם בעיקר קולטנים. כל אוכלוסיית לויקוציטים מבטאת שילוב מסוים של קולטנים (למשל, ציטוטוקסיים, הפעלה, קולטני הגירה) שיכולים להגדיר תת-קבוצות בקרב אוכלוסיות. מכיוון שמערכת החיסון מקיפה מגוון רחב של אוכלוסיות תאים, חיוני לאפיין אותן כדי לפענח את השתתפותן בתגובה החיסונית.

ציטומטריית זרימה (FC או FCM) היא שיטה נפוצה לניתוח הביטוי של פני השטח של התא ומולקולות תאיות, אפיון והגדרת סוגי תאים שונים בתערובת תאים הטרוגניים. ציטומטרי זרימה מורכבים משלוש תתי-מערכות עיקריות: נוזלים, אופטיקה ואלקטרוניקה. מערכת הנוזלים מעבירה את התאים בזרם כך שהם עוברים מול לייזר בזה אחר זה. מערכת האופטיקה מורכבת ממקורות אור (לייזרים) להארת החלקיקים, מסננים אופטיים לכוון את האור המתקבל, ואותות פלואורסצנטיים לגלאים מתאימים. לבסוף, מערכת האלקטרוניקה ממירה את אותות האור שזוהו לאותות אלקטרוניים שניתן לעבד על ידי המחשב. כאשר תא בודד עובר מול קרן הלייזר, הוא מפזר אור. גלאי מול הקרן מודד פיזור קדימה (FS) ומספר גלאים לצד למדוד פיזור צד (SC). ה- FS מתואם עם גודל התא ו- SC הוא פרופורציונלי לפרטיון התאים. באופן זה, אוכלוסיות תאים לעתים קרובות ניתן להבחין בהתבסס על הבדלים בגודלם ובגרגריותם בלבד.

בנוסף לניתוח גודלו, צורתו ומורכבותו של התא, ציטומטריית הזרימה נמצאת בשימוש נרחב לזיהוי הביטוי של קולטני פני התא (1). זה מושג באמצעות נוגדנים חד שבטיים בעלי תווית פלואורוכרום אשר נקשרים לקולטנים ידועים ספציפיים לתא. עם עירור, פלואורוכרום קשור זה פולט אור של אורך גל מסוים, הנקרא אורך גל פליטה, אשר ניתן לזהות ולהבקיע. מדידות פלואורסצנטיות מספקות נתונים כמותיים ואיכותיים על קולטני פני תא המסומנים בפלואורוכרום. המטולוגים היו הראשונים להשתמש FC למעקב טיפולי של אוכלוסיות תאי החיסון (2). עכשיו, הוא משמש עבור מגוון רחב של יישומים כגון אימונופנוטיפינג, כדאיות תאים, ביטוי גנים, ספירת תאים, וניתוח GFP.

FACS (פלואורסצנטי מופעל Cell Sorter) הוא סוג מיוחד של ציטומטריית זרימה, אשר ממיין אוכלוסייה של תאים לתוך תת-אוכלוסייה באמצעות תיוג פלואורסצנטי. בדיוק כמו ציטומטריית זרימה קונבנציונלית, נתונים ראשונים FS, SC, פלואורסצנטי נאספים. לאחר מכן, המכונה מחילה מטען (שלילי או חיובי) ומערכת הסטה אלקטרוסטטית (אלקטרומגנטים) מקלה על איסוף טיפות טעונות המכילות תאים לצינורות מתאימים.

איור 1: ייצוג סכמטי של FACS. מדגם (1) שאפתן ב- FACS (2) ומועבר מול הלייזר (3). פלואורסצנטיות של תאים חשה בגלאי פלואורסצנטיות (4). לבסוף, התאים משולבים בטיפות ותאי העניין נוטים על ידי לוחות הסטה (5) ונאספים בצינור איסוף (6). התאים הנותרים נכנסים לפח (7). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

היבט המיון של ה- FACS מציג יתרונות רבים. בדיקות רבות יכולות לעזור להבין את תפקידם של תאים ספציפיים במערכת החיסון, כגון ניתוחים של ביטוי גנים כמו RT-qPCR, מחזור תאים או הפרשת ציטוקינים. עם זאת, יש לטהר תאים במעלה הזרם כדי לקבל תוצאות ברורות וספציפיות. כאן, FACS מגיע שימושי ואת התאים הרצויים ניתן למיין עם טוהר גדול, מניב תוצאות אמינות מאוד לשחזור. FACS יכול לשמש גם כדי למיין תאים המבוססים על כתמים תאיים גרעיניים או אחרים ועל פי נוכחות, היעדר, וצפיפות של קולטני פני השטח. FACS היא כעת טכניקה סטנדרטית לטיהור של תת-אוכלוסיות של תאים ויש לה את היכולת למיין עד ארבע אוכלוסיות בו זמנית.

תרגיל מעבדה זה מדגים כיצד לבודד לויקוציטים בטחול ולאחר מכן כיצד למיין באופן ספציפי תאי לימפה B מתערובת תאי לויקוציטים בטחול באמצעות FACS.