Fuente: Perchet Thibaut^1,2,3, Meunier Sylvain^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
1 Unidad de Linfopoyesis, Departamento de Inmunología, Instituto Pasteur, París, Francia
² INSERM U1223, París, Francia
³ Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, París, Francia
⁴ Flow Cytometry Platfrom, Citometría y Biomarcadores UtechS, Centro de Ciencias Traslacionales, Instituto Pasteur, París, Francia

La función general del sistema inmunológico es defender el cuerpo contra organismos infecciosos y otros invasores. Los glóbulos blancos, o leucocitos, son los actores clave del sistema inmunitario. Tras la infección, se activan e inician una respuesta inmunitaria. Los leucocitos se pueden dividir en varias subpoblaciones (por ejemplo, células mieloides, linfocitos, células dendríticas) basándose en diferentes parámetros que pueden ser biológicos, físicos y/o funcionales (por ejemplo, tamaño, granularidad y secreción). Una forma de caracterizar a los leucocitos es a través de sus proteínas superficiales, que son principalmente receptores. Cada población de leucocitos expresa una combinación específica de receptores (por ejemplo, citotóxicos, activadores, receptores de migración) que pueden definir subconjuntos entre las poblaciones. Como el sistema inmunitario abarca una amplia gama de poblaciones celulares, es esencial caracterizarlas para descifrar su participación en la respuesta inmunitaria.

La citometría de flujo (FC o FCM) es un método ampliamente utilizado para analizar la expresión de la superficie celular y las moléculas intracelulares, caracterizando y definiendo diferentes tipos de células en una mezcla de células heterogéneas. Los citometros de flujo se componen de tres subsistemas principales: fluidos, ópticos y electrónicos. El sistema de fluidos transporta las células en una corriente de tal manera que pasan delante de un láser uno por uno. El sistema óptico consta de fuentes de luz (láser) para iluminar las partículas, filtros ópticos para dirigir la luz resultante y señales fluorescentes a los detectores adecuados. Por último, el sistema electrónico convierte las señales de luz detectadas en señales electrónicas que pueden ser procesadas por el ordenador. A medida que una célula individual pasa delante del rayo láser, dispersa la luz. Un detector delante del haz mide la dispersión hacia adelante (FS) y varios detectores hacia el lado de la dispersión lateral (SC). El FS se correlaciona con el tamaño de celda y SC es proporcional a la granularidad de las células. De esta manera, las poblaciones celulares a menudo se pueden distinguir en función de las diferencias en su tamaño y granularidad solamente.

Además de analizar el tamaño, la forma y la complejidad de una célula, la citometría de flujo se utiliza ampliamente para detectar la expresión de los receptores de superficie celular (1). Esto se logra mediante el uso de anticuerpos monoclonales etiquetados con fluorocromo que se unen a receptores específicos de células conocidos. Tras la excitación, estos fluorocromos enlazados emiten una luz de longitud de onda específica, llamada longitud de onda de emisión, que puede ser detectada y puntuada. Las mediciones de fluorescencia proporcionan datos cuantitativos y cualitativos sobre los receptores de superficie celular etiquetados con fluorocromo. Los hematólogos utilizaron por primera vez la FC para el seguimiento terapéutico de las poblaciones de células inmunitarias (2). Ahora, se utiliza para una amplia gama de aplicaciones tales como inmunofenotipado, viabilidad celular, expresión génica, recuento celular y análisis de GFP.

FACS (Fluorescent Activated Cell Sorter) es un tipo especializado de citometría de flujo, que ordena una población de células en subpoblación utilizando etiquetado fluorescente. Al igual que la citometría de flujo convencional, se recopilan los primeros datos FS, SC y fluorescentes. A continuación, la máquina aplica una carga (negativa o positiva) y un sistema de desviación electrostática (electroimanes) facilita la recolección de gotas cargadas que contienen células en tubos apropiados.

Figura 1: Representación esquemática de FACS. La muestra (1) se aspira en el FACS (2) y se pasa delante del láser (3). La fluorescencia celular es sintensada por detectores de fluorescencia (4). Finalmente, las células se incorporan en gotas y las células de interés son desviadas por placas de desviación (5) y recogidas en un tubo de recolección (6). Las celdas restantes entran en la basura (7). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El aspecto de clasificación del FACS presenta muchas ventajas. Muchas pruebas pueden ayudar a entender el papel de las células específicas en el sistema inmunitario, como los análisis de la expresión génica como RT-qPCR, ciclo celular o secreción de citoquinas. Sin embargo, las células deben purificarse aguas arriba para obtener resultados claros y específicos. Aquí, FACS viene en útil y las células deseadas se pueden clasificar con gran pureza, produciendo resultados altamente confiables y reproducibles. FacS también se puede utilizar para clasificar las células en función de la tinción nuclear u otra intracelular y de acuerdo con la presencia, ausencia y densidad de los receptores de superficie. FACS es ahora una técnica estándar para la purificación de subpoblaciones de células y tiene la capacidad de ordenar hasta cuatro poblaciones simultáneamente.

Este ejercicio de laboratorio demuestra cómo aislar leucocitos esplénicos y luego cómo clasificar específicamente las células linfoides B de la mezcla de células de leucocitos esplénicos utilizando FACS.