Fonte: Meunier Sylvain^1,2,3, Perchet Thibaut^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
1 Unidade de Linfopose, Departamento de Imunologia, Instituto Pasteur, Paris, França
² INSERM U1223, Paris, França
³ Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, França
⁴ Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, França

A defesa contra patógenos depende da vigilância do sistema imunológico. Este sistema é complexo e compreende muitos tipos de células, cada uma com funções específicas. Essa composição complexa permite respostas imunes a uma grande diversidade de patógenos e lesões. A imunidade adaptativa permite respostas específicas contra patógenos específicos. A maioria das células responsáveis por esse tipo de imunidade são os linfócitos (células B e células T). Geralmente, as células B respondem a infecções extracelulares (como infecções bacterianas), e as células T respondem a infecções intracelulares (como infecções virais). Os diferentes tipos de células em populações de linfócitos podem ser caracterizados pela combinação de proteínas de superfície celular que expressam e/ou por um painel de citocinas secretadas.

A classificação magnética permite o enriquecimento de populações de células-alvo usando propriedades magnéticas e expressão de uma ou várias proteínas da superfície celular (1, 2). Esta técnica consiste em três passos. Primeiro, as células são incubadas com contas magnéticas que são acopladas a um ou vários anticorpos monoclonais específicos. Células que expressam proteínas superficiais que se ligam a esses anticorpos se prendem às contas magnéticas. Então, as populações de células-alvo são capturadas com um ímã. Para terminar, as células-alvo são eluidas do ímã. No final, são obtidos dois produtos de triagem, um contendo células não rotuladas e o segundo contendo as células-alvo, juntamente com as contas magnéticas. Colunas podem ser usadas para melhorar a eficiência da classificação magnética. Na coluna, um elemento não magnético alonga o caminho da célula através da coluna. Assim, o fluxo celular é desacelerado, facilitando a captura celular pelo ímã.

Figura 1: Representação esquemática da separação magnética. Leucócitos timimicos estão manchados com anticorpos biotinilados anti-CD3. Após a lavagem, streptavidin (SAV) acoplado contas especificamente fixam a biotina em anticorpos anti-CD3. (1) As células são transferidas em uma coluna. (2) O ímã não retém células não rotuladas, enquanto as células CD3 positivas permanecem na coluna. Finalmente, a coluna é separada do ímã e (3) células CD3 positivas são elucidadas em média. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Existem dois tipos de classificação magnética (3). Em classificação positiva, células de interesse são capturadas com as contas magnéticas. Na classificação negativa, as células indesejadas são removidas capturando com as contas magnéticas carregando os anticorpos apropriados. Esta técnica macs permite um bom enriquecimento de células-alvo e melhora a porcentagem de células recuperadas de 1-20% para 60-98% em um órgão. Após a triagem, é necessário verificar a pureza celular e a classificação por diferentes métodos (por exemplo, citometria de fluxo). A técnica MACS é ideal para enriquecer uma população-alvo para outros experimentos, como cultura celular ou análise de ciclo celular.

Neste exercício de laboratório, demonstramos como isolar leucócitos timiços e, posteriormente, enriquecer células timmicas CD3 positivas da mistura usando a técnica de classificação celular magnética.