Quelle: Meunier Sylvain^1,2,3, Perchet Thibaut^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
1 Einheit für Lymphopoiese, Institut für Immunologie, Pasteur Institute, Paris, Frankreich
² INSERM U1223, Paris, Frankreich
³ Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, Frankreich
⁴ Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, Frankreich

Die Abwehr von Krankheitserregern hängt von der Überwachung durch das Immunsystem ab. Dieses System ist komplex und umfasst viele Zelltypen, von denen jeder spezifische Funktionen hat. Diese komplexe Zusammensetzung ermöglicht Immunreaktionen auf eine große Vielfalt von Krankheitserregern und Verletzungen. Die adaptive Immunität ermöglicht spezifische Reaktionen gegen bestimmte Krankheitserreger. Die Mehrheit der Zellen, die für diese Art der Immunität verantwortlich sind, sind die Lymphozyten (B-Zellen und T-Zellen). In der Regel reagieren B-Zellen auf extrazelluläre Infektionen (z. B. bakterielle Infektionen) und T-Zellen auf intrazelluläre Infektionen (z. B. Virusinfektionen). Die verschiedenen Zelltypen in Lymphozytenpopulationen können durch die Kombination von Zelloberflächenproteinen, die sie exprimieren, und/oder durch eine Gruppe von abgesonderten Zytokinen charakterisiert werden.

Die magnetische Sortierung ermöglicht die Anreicherung von Zielzellpopulationen unter Verwendung magnetischer Eigenschaften und expressionierung eines oder mehrerer Zelloberflächenproteine (1, 2). Diese Technik besteht aus drei Schritten. Zunächst werden die Zellen mit magnetischen Perlen inkubiert, die mit einem oder mehreren monoklonalen Antikörpern gekoppelt sind. Zellen, die Oberflächenproteine ausdrücken, die an diese Antikörper binden, heften sich an die magnetischen Perlen. Dann werden die Zielzellpopulationen mit einem Magneten erfasst. Zum Abschluss werden die Zielzellen vom Magneten eluiert. Am Ende werden zwei Sortierprodukte erhalten, eines mit nicht beschrifteten Zellen und das zweite mit den Zielzellen gekoppelt mit den Magnetperlen. Säulen können verwendet werden, um die Effizienz der magnetischen Sortierung zu verbessern. In der Spalte verlängert ein nichtmagnetisches Element den Pfad der Zelle durch die Spalte. Daher wird der Zellfluss verlangsamt, was die Zellerfassung durch den Magneten erleichtert.

Abbildung 1: Schematische Darstellung der magnetischen Trennung. Thymische Leukozyten sind mit Anti-CD3-biotinylierten Antikörpern gefärbt. Nach dem Waschen fixieren Streptavidin (SAV) gekoppelte Perlen das Biotin gezielt auf Anti-CD3-Antikörper. (1) Zellen werden in eine Spalte übertragen. (2) Der Magnet behält keine unbeschrifteten Zellen, während CD3-positive Zellen in der Spalte verbleiben. Schließlich wird die Säule vom Magneten getrennt und (3) CD3-positive Zellen werden im Medium eluiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Es gibt zwei Arten der magnetischen Sortierung (3). Bei der positiven Sortierung werden Von interessede Zellen mit den Magnetperlen erfasst. Bei der negativen Sortierung werden unerwünschte Zellen entfernt, indem sie mit den magnetischen Perlen, die die entsprechenden Antikörper tragen, aufgenommen werden. Diese MACS-Technik ermöglicht eine gute Anreicherung von Zielzellen und verbessert den Anteil der zurückgewonnenen Zellen von 1-20% auf 60-98% in einem Organ. Nach der Sortierung ist es notwendig, die Zellreinheit und die Sortierung nach verschiedenen Methoden (z.B. Durchflusszytometrie) zu überprüfen. Die MACS-Technik ist ideal, um eine Zielpopulation für andere Experimente wie Zellkultur oder Zellzyklusanalyse zu bereichern.

In dieser Übungseinheit zeigen wir, wie thymische Leukozyten isoliert und anschließend thymische CD3-positive Zellen aus dem Mix mit der magnetischen Zellsortierungstechnik angereichert werden können.