Fonte: Meunier Sylvain^1,2,3, Perchet Thibaut^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
1 Unità di Linfopoiesi, Dipartimento di Immunologia, Istituto Pasteur, Parigi, Francia
² INSERM U1223, Parigi, Francia
³ Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Parigi, Francia
⁴ Platfrom, Citometria a flusso e biomarcatori UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Parigi, Francia

La difesa contro gli agenti patogeni dipende dalla sorveglianza da parte del sistema immunitario. Questo sistema è complesso e comprende molti tipi di cellule, ognuna con funzioni specifiche. Questa complessa composizione consente risposte immunitarie a una grande varietà di agenti patogeni e lesioni. L'immunità adattativa consente risposte specifiche contro agenti patogeni specifici. La maggior parte delle cellule responsabili di questo tipo di immunità sono i linfociti (cellule B e cellule T). Di solito, le cellule B rispondono alle infezioni extracellulari (come le infezioni batteriche) e le cellule T rispondono alle infezioni intracellulari (come le infezioni virali). I diversi tipi di cellule nelle popolazioni di linfociti possono essere caratterizzati dalla combinazione di proteine di superficie cellulare che esprimono e/o da un pannello di citochine secrete.

La selezione magnetica consente l'arricchimento di popolazioni cellulari mirate utilizzando proprietà magnetiche ed espressione di una o più proteine di superficie cellulare (1, 2). Questa tecnica consiste di tre passaggi. In primo luogo, le cellule vengono incubate con perle magnetiche che sono accoppiate con uno o più anticorpi monoclonali specifici. Le cellule che esprimono proteine di superficie che si legano a questi anticorpi si attaccano alle perle magnetiche. Quindi, le popolazioni cellulari mirate vengono catturate con un magnete. Per finire, le cellule bersaglio vengono eluite dal magnete. Alla fine, si ottengono due prodotti di selezione, uno contenente cellule non etichettate e il secondo contenente le cellule bersaglio accoppiate con le perli magnetiche. Le colonne possono essere utilizzate per migliorare l'efficienza dello smistamento magnetico. Nella colonna, un elemento non magnetico allunga il percorso della cella attraverso la colonna. Quindi, il flusso cellulare viene rallentato, facilitando la cattura cellulare da parte del magnete.

Figura 1: Rappresentazione schematica della separazione magnetica. I leucociti timici sono colorati con anticorpi biotinilati anti-CD3. Dopo il lavaggio, le perle accoppiate alla streptavitina (SAV) fissano specificamente la biotina sugli anticorpi anti-CD3. (1) Le celle vengono trasferite in una colonna. (2) Il magnete non trattiene le celle non etichettate, mentre le celle CD3-positive rimangono nella colonna. Infine, la colonna viene separata dal magnete e (3) le cellule CD3-positive vengono eluite nel mezzo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Esistono due tipi di smistamento magnetico (3). Nella selezione positiva, le cellule di interesse vengono catturate con le pere magnetiche. Nella selezione negativa, le cellule indesiderate vengono rimosse catturando con le pere magnetiche che trasportano gli anticorpi appropriati. Questa tecnica MACS consente un buon arricchimento delle cellule bersaglio e migliora la percentuale di cellule recuperate dall'1-20% al 60-98% in un organo. Dopo lo smistamento, è necessario verificare la purezza cellulare e lo smistamento con metodi diversi (ad esempio citometria a flusso). La tecnica MACS è ideale per arricchire una popolazione target per altri esperimenti come la coltura cellulare o l'analisi del ciclo cellulare.

In questo esercizio di laboratorio, dimostriamo come isolare i leucociti timici e successivamente arricchire le cellule timiche CD3-positive dal mix usando la tecnica di selezione delle cellule magnetiche.